1. Dụng cụ và hóa chất
Các dụng cụ và hóa chất thông thường của phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thuộc khoa Sinh học trường Đại học Khoa học, Đại học Huế.
DEAE- cellulose do hãng Sigma (Mỹ) sản xuất. Các hóa chất khác dưới dạng tinh khiết.
Chất chống đông ACD-A, hồng cầu và huyết thanh các nhóm máu người do khoa Huyết học và truyền máu ‘bệnh viện Trung Ương Huế cung cấp. Máu được pha loãng bằng nước muối sinh lý NaCl 9% đến 3-5%
Hóa chất sử dụng trong điện di SDS-PAGE là hoá chất của các hãng Sigma (Mỹ) và Merck (Đức) sản xuất.
2. Xử lý mẫu vật
Tiến hành gieo đậu theo thời vụ địa điểm:bãi bồi ven sông thuộc làng Hương Chữ, huyện Hương Trà, TT Huế.
Thu các cơ quan rễ, thân, lá, hoa, quả, hạt ở các giai đoạn sinh trưởng và phát triển khác nhau (Bảng 2.1). Mẫu nghiên cứu được rửa sạch, sau đó mẫu được nghiền mịn trong cối sứ và chiết rút bằng đệm PBS pH 7,2 theo tỷ lệ 1:5 (1 gam mẫu: 5 ml đệm), ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 30 phút, loại bã và thu dịch trong (địch thô) để tiến hành các thí nghiệm. Các thí nghiệm đều tiến hành với mẫu dịch thô để xác định hàm lượng protein, hoạt độ lectin và đặc trưng phổ điện di protein.
Bảng 2.1. Các thời kỳ sinh trưởng và phát triển của đậu theo hướng dẫn của Beinroth
Thời kỳ STPT Ký hiệu Đặc điểm phân biệt
Sinh trưởng sinh dưỡng
Mọc VO 50% số cây xòe 2 lá mầm trên mặt đất
Lá đơn VI 50% số cây xòe 2 lá đơn.
1 lá kép V2 50% số cây xòe 1 lá kép (3 đốt)
2 lá kép V3 50% số cây xòe 2 lá kép (4 đốt)
3 lá kép
n-1 lá kép (thân chính) V4 50% số cây xòe n-1 lá thật (n đốt)
Sinh trưởng sinh thực
Bắt đầu ra hoa RI 50% số cây cỏ hoa ở bất cứ đốt nào
Hoa rộ R2 50% số cây có hoa trên các đốt. kích
thước tối đa.
Bắt đầu làm quả R3 50% số cây có 1 quà dài 0,5 cm nằm ở 1 trong 4 đốt trên cùng có lá kép đạt kích
thước tối đa.
Làm quả rộ. R4 50% số cây có 1 quả dài 0.5 cm nằm ở 1 trong 4 đốt trên cùng có lá đạt kích thước
tối đa.
Làm hạt R5 50% số cây có hạt trong nằm ở 1 trong 4 đốt có lá kép đạt kích thước tối đa.
Quả chăc R6 50% số cây có 1 quả đạt kích thước tối đa.
Chín sinh lý R7 50% sổ cây có quả chuyển sang màu vàng và 50% số lá chuyển màu vàng Chín thu hoạch R8 50% số cây có 95% số quả có màu nâu có
thể thu hoạch.
3. Phương pháp xác định hoạt độ lectin
Hoạt độ lectin, viết tắt HAA (Hemogglutinating activity), là khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu. Hoạt độ đó được xác định bằng phương pháp Gebauer [24]: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Đùng đĩa nhựa (Microtitter system) 96 giếng gồm 8 hàng có ký hiệu A, B, C, D, E, F, G, H và mỗi hàng có 12 giếng đánh số thứ tự từ 1 đến 12, đĩa nhựa sạch và khô.
- Dùng micropipetter cho vào mỗi giếng 50 µl đệm PBS pH 7,2.
- Lấy 50 µl mẫu đưa vào giếng thứ nhất trộn đều, lấy ra 50 µl từ giếng thứ nhất đưa sang giếng thứ 2 trộn đều rồi lại lấy 50 µl từ giếng thứ 2 đưa sang giếng thứ 3, trộn đều và lấy ra 50 µl.. cứ thế cho đến giếng thứ 10 hoặc 11 rồi lấy ra 50 µl bỏ đi. Một hoặc 2 giếng cuối cùng dùng làm đối chứng.
Như vậy ta có nồng độ pha loãng dần với số lần 2n (n là số giếng).
- Cho hồng cầu vào mỗi hàng từ số 1 đến số 12 với thể tích là 50 µl để thể tích cuối cùng trong mỗi giếng là 100 µl.
Ở đây ta chỉ sử dụng một nhóm máu đó là nhóm máu A cho phản ứng ngưng kết mạnh với lectin của hạt đậu ngự (Phaseoius iunatus L.).
Để yên đĩa nhựa mẫu đã thí nghiệm ở nhiệt độ phòng trong khoảng ½ đến 2 giờ tiến hành đọc kết quả, giếng 12 không có lectin thì hồng cầu tụ gọn xuống đáy giếng. Đối với những giếng khác, những giếng giống giếng 12 thì không có lectin, những giếng có hiện tượng ngưng kết (kết màng không tụ lắng xuống) là có lectin. Các giếng ngưng kết được tính từ giếng 1 đến giếng có mức ngưng kết ít nhất (bắt đầu ngưng tụ hồng cầu xuống đáy giếng).
3.1. Hoạt độ chung (HĐC)
Xác định hoạt động ngưng kết hồng cầu theo phương pháp của Gebauer trên bảng Microtitter system. Một đơn vị hoạt độ được tính là giá trị nghịch đảo của độ pha loãng lớn nhất mà ở đó còn có khả năng gây ngưng kết hồng cầu của người. HĐC (ĐV/ml) = 2n/v
Trong đó: n là số giếng còn có hoạt tính lectin. V là thể tích của mẫu thí nghiệm (ml).
3.2. Hoạt độ riêng (HĐR)
HĐR là giá trị hoạt độ của lectin trong lmg protein. HĐR có giá trị lớn chứng tỏ tỷ lệ lectin trong lmg protein là lớn. Vì vậy HĐR là chỉ só quan trọng đánh giá mức độ sạch của protein trong quá trình tinh chế.
HĐR (Đv/mg protein) = HĐC/mg protein. Trong đó: HĐC là hoạt độ chung
mg protein là hàm lượng protein
3.3. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp quang phổ
Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 280 nm và 260 nm trên quang phổ kế hiệu UV/Visible spectrophotometer Ultrospec 2000 [10].
Hàm lượng protein được tính theo công thức: C(pr) = (1,55 X A280 – 0,77 X A260) X D (mg/ml)
Trong đó: C(pr): Hàm lượng protein (mg/ml).
A260 : Độ hấp thụ quang của mẫu ở bước sổng 260 nm. A280 : Độ hấp thụ quang của mẫu ở bước sóng 280 nm. D : Độ pha loãng của dung dịch mẫu.
3.4. Nghiên cứu đặc trưng củaprotein bằng điện diSDS-PAGE
Nghiên cứu đặc trưng protein bằng điện di SDS-PAGE theo LaemLi [34] Quy trình điện di:
- Chuẩn bị gel
+ Pha dung dịch separating gel (12%)) H2O: 1,98 ml
Acrylamide (30%): 2,4 ml Separating buffer: : 1,5 ml APS (10%): 120 µl TEMED: 4,8 µl
Vortex khoảng 1-2 phút rồi đổ nhanh vào giữa hai tấm kính lên đến ¾ độ cao tấm kính, cho nhanh nước cất vô trùng lên trên gel. Sau khi gel đông, đổ nước cất ra và làm khô bề mặt gel bằng giấy thấm.
+ Pha dung dịch stacking gel (5%) H2O: 1,35 ml
Acrylamide (30%): 0,335 ml Stacking buffer: 0,25 APS 10%): 20 µl TEMED: 2 µl Vortex khoảng 1 phút,đổ nhanh vào giữa hai tấm kính,lên trên separating gel cho hết độ cao tấm kính. Gắn nhanh lược vào, tránh bọt khí ở răng lược. Theo dõi gel đông, nếu cần thì bổ sung thêm stacking gel dể làm đày mép gel.
- Chuẩn bị mẫu:
Các mẫu lá ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng và phát triển và hạt của giai đoạn chín thu hoạch của cây đậu được dùng làm mẫu tiến hành điện di.
Tính toán lấy lượng mẫu chứa khoảng 15-30 µg protein và 3 µl đệm tải mẫu (gồm Tris 2M, SDS, glucerol, β-mercaptoethanol, bromophenol blue) sao cho tổng thể tích mẫu khoảng 15 µl Rồi gây biến tính bằng cách đun nóng 95°C trong 5 phút. - Tiến hành điện di: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau khi gel đã đông hoàn toàn, cẩn thận tháo khuôn gel ra khỏi giá đỡ và khung. Gắn khuôn gel vào buồng điện di và làm đầy buồng điện di bằng đệm điện di (gồm Tris, glycerol, SDS). Cẩn thận tháo lược ra khỏi gel, sử dụng micropopette để phá bọt khí ra khỏi đáy gel và các giếng.
Dùng micropipette để tải mẫu vào các giếng.
Nối buồng điện di với bộ nguồn chạy điện di ở điện thế 80V cường độ dòng điện là 40 mA trong khoảng 2,5-3 giờ cho đến khi vạch màu đi hết độ dài tấm gel. - Nhuộm và rửa geỉ:
Tháo gel ra khỏi khuôn dưới dòng nước nhẹ để dễ dàng tách hai tấm kính ra Cho gel vào dung dịch thuốc nhuộm Coomassie blue lắc nhẹ trong vòng 20 phút. Sau đó tiến hành rứa gel bằng dung dịch thuốc rửa gel, lắc nhẹ trong khoảng 10 phút thay dung dịch rửa vài lần đến khi hoàn thành, cuối cùng bảo quản trong nước cất.
PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN