CHƯƠNG 2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
2.2. Các phương pháp xác định hàm lượng pectin trong mẫu thực phẩm
2.2.3. Phương pháp so màu Carbazole
2.2.3.1. Giới thiệu
Phương pháp Carbazole: là phương pháp phân tích đo quang phổ pectin lần đầu được đề xuất bởi Dische (1946), bao gồm các bước chiết tách pectin từ thịt quả rau củ, depolymer pectin bằng acid sulfuric, phản ứng tạo màu với carbazole và đo quang phổ.
2.2.3.2. Nguyên tắc
Carbazole là một hydrocarbon thơm đa vòng gồm hai vòng benzen sáu cạnh được hợp nhất ở hai bên của một vòng chứa nitơ năm cạnh. Carbazole thường được ứng dụng như cầu liên hợp π để tạo ra thuốc nhuộm hữu cơ. Phản ứng tạo màu dựa trên phản ứng màu giữa các sản phẩm phân hủy của quá trình thủy phân pectin bằng acid đậm đặc với carbazole. Màu sắc thu được tỷ lệ thuận với nồng độ của galacturonic acid.
2.2.3.3. Ứng dụng
Phương pháp so màu Carbazole thường được sử dụng để xác định hàm lượng pectin trong trái cây và rau củ như đào, cà rốt, cam, chanh và cà chua. Trong những năm gần đây, phản ứng tạo màu của carbazole được sử dụng để xác định hàm lượng galacturonic acid của các polysaccharides trong phế phẩm nông nghiệp như vỏ bưởi, vỏ thanh long.
2.2.3.4. Chuẩn bị
✓ Hóa chất
Pectin Ethanol 95% và 63%
Thuốc thử Carbazole 0.1% Sulfuric acid đậm đặc
✓ Dụng cụ - Thiết bị Erlen 100mL Beaker 100mL Ống nghiệm Pipette Syringe
2.2.3.5. Cách tiến hành
✓ Pha thuốc thử Carbazole 0.1%
Hịa tan 0.1g carbazole bằng ethanol trong bình định mức đến vạch 100ml, lắc đều cho đến khi tan
hoàn toàn.
Bước 1: Cân mẫu pectin bằng cân phân tích.
Bước 2: Kết tủa mẫu pectin với lần lượt ethanol 95% và 63%. Sau đó, sấy khơ kết tủa và pha
lỗng mẫu bằng nước cất đến nồng độ 0.025%.
Bước 3: Cho 0.5mL thuốc thử carbazole 0.1% và 5 - 6mL sulfuric acid đậm đặc vào ống nghiệm
nhanh chóng trong 6s và lắc đều.
Bước 4: Đun nóng ống nghiệm đến 85 - 100℃ trong 5 - 10 phút. Bước 5: Làm nguội ống nghiệm trong bể đá trong 5 phút.
Bước 6: Cho lần lượt các mẫu vào lọ đựng bằng syringe để đo quang phổ. Độ hấp thụ được
đo bằng máy quang phổ chùm tia đôi 525nm sử dụng cuvette 1 cm.
Bước 7: Phép đo được thực hiện song song đối với mẫu trắng bao gồm 1ml nước cất, 0.5mL
thuốc thử carbazole 0.1% và 5 - 6mL sulfuric acid đậm đặc.
Lặp lại tương tự trong 3 lần.
2.2.3.6. Tính tốn kết quả
Định lượng pectin trong mẫu cần xác định bằng phương trình Lambert-Beer:
= × ×
Trong đó: A: Độ hấp thụ
ε: Độ hấp thụ mol (LM-1cm-1)
b: Chiều dày cuvette (cm) Cx: Nồng độ mẫu (mol/L)
Khi dung dịch cần xác định và dung dịch chuẩn có cùng chiều dày cuvette, ta có cơng thức:
b = const ⇒ Cx A X × ε
acid D−Galactu ronic
= Aacid D−Galacturonic × εX × Cacid D−Galacturonic
✓ Khối lượng acid D-Galacturonic trong mẫu được tính theo cơng thức như sau:
✓
macid D−Galacturonic = M × Cx × Vx
AX × εa cid D−Ga la ctu ron ic
= Aacid D−Galacturonic × εX × Cacid D−Galacturonic× Vx× M
16
✓Hàm lượng acid D-Galacturonic trong mẫu được tính theo cơng thức sau:
%D
%D − Galacturonic acid
Trong thế kỷ XIX, khi mà kiến thức về pectin của các loại thực phẩm vẫn chưa được khám phá và mở rộng như bây giờ, các nhà khoa học lúc bấy giờ cho rằng tổng hàm lượng đơn phân D-Galacturonic acid cũng chính là tổng khối lượng pectin trong thực phẩm, do đó hàm lượng D-Galacturonic acid trong thực phẩm cũng chính là hàm lượng pectin trong mẫu thực phẩm. Tuy nhiên, hiện nay người ta đã phát hiện rằng tổng khối lượng D-Galacturonic acid chỉ chiếm tối thiểu 80% trong thực phẩm (không đạt tới 100%) phụ thuộc vào bản chất loại thực phẩm. Do đó cơng thức trên chưa hồn tồn chính xác. Để phù hợp với thực tế, ta nên bổ sung cho công thức trên bằng một hệ số thực nghiệm θ (θ ≥ 80%) để tính chính xác hàm lượng pectin trong mẫu trái cây hoặc thực phẩm.
macid D−Galacturonic = mpectin × θ
%acid D − Galacturonic = %pectin × θ
17
CHƯƠNG 3. BÀN LUẬN VÀ KẾT LUẬN3.1. Bàn luận chung 3.1. Bàn luận chung
3.1.1. Năng lực của phương pháp Calcium pectate
Trong công nghệ thực phẩm, phương pháp Calciumum pectate là một trong những phương pháp xác định hàm lượng pectin được ưa chuộng nhất trên thế giới. Bởi vì phương pháp này có độ chính xác cao, tính lặp lại cao, chi phí thấp và ngồi ra cịn hạn chế sự ơ nhiễm mơi trường. Sau đây là một số nơi sử dụng phương pháp này với các phạm vi thực phẩm khác nhau ở Bảng 3:
Bảng 3. Hàm lượng pectin trong sương sáo Việt Nam
Sương sáo tươi Tiền Giang
Bảng 4. Hàm lượng pectin của các thành phần khác nhau bên trong mít ở Ấn Độ
Như ta đã thấy, hệ số biến thiên hàm lượng pectin của các thành phần sản phẩm thực phẩm là vô cùng thấp (thấp nhất là 0.10%, cao nhất là 0.16%), điều này cho thấy rằng phương pháp này có độ chính xác và độ lặp lại rất cao. Ngồi ra, ta thấy rằng phương pháp có tính phổ biến cao, sử dụng rộng rãi với hầu hết tất cả các loại thực phẩm với kết quả chính xác nhất bất kể là loại thực phẩm nào hoặc vùng địa hình địa lý nào. Phương pháp này hiện nay được coi là một trong những phương pháp xác định hàm lượng pectin mạnh nhất bây giờ.
3.1.2. Năng lực của phương pháp đo quang phổ thông qua ion Cu2+
Phương pháp đo quang phổ thông qua ion Cu2+ là một phương pháp xác định hàm lượng pectin trong thực phẩm xuất hiện trong năm 2021, được phát triển bởi nhóm nghiên cứu Trung Quốc nhằm cung cấp thêm phương pháp xác định hàm lượng pectin cũng như là đơn giản hóa quy trình nghiên cứu bằng cách sử dụng máy đo quang phổ. Mặc dù phương pháp này chưa được phổ biến và sử dụng rộng rãi trên thế giới nhưng đã chứng minh được tiềm năng trong tương lai và chứng minh được khả năng xác định hàm lượng pectin cịn chính xác hơn phương pháp Calcium pectate.
Để xác minh độ chính xác của phương pháp này, người ta phân tích độ lặp lại của phương pháp bằng cách tính độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của phép đo quang phổ ion Cu2+ trong 4 phép đo là 2.60%; 1.10%; 0.14%; 0.31% (<3%). Từ đó cho thấy rằng phương pháp này có độ lặp lại tốt và độ chính xác cao.
Ngồi ra, ta cũng sử dụng 4 mẫu có hàm lượng pectin khác nhau để thực hiện song song 2 phương pháp Calcium pectate và đo quang phổ ion Cu2+ để xác minh tính chính xác và độ tin cậy của phương pháp
đo quang phổ ion Cu2+ và kết quả được thể hiện trong bảng 1. Có thể thấy rằng hàm lượng pectin được
đo
bằng phương pháp này có kết quả chính xác hơn hoặc gần đúng với phương pháp Calcium pectate.
Bảng 5. Khối lượng pectin trong mẫu thực phẩm được xác định bằng 2 phương pháp đo quang phổ
thông qua ion Cu2+ và Calcium pectate
Mẫu
1 2 3 4
Để xác nhận tính phổ biến đối với các loại thực phẩm khác nhau, phương pháp đo quang phổ thông
qua ion Cu2+ và phương pháp Calcium pectate đã được sử dụng tương ứng để xác định hàm lượng pectin
của một số nguồn thực vật khác nhau. Vỏ của cây dâu tằm giấy, sợi dứa, và Chi Niệt dó được chọn làm nguyên liệu để phân tích.
Bảng 6. Khối lượng pectin trong các mẫu thực phẩm đa dạng bằng 2 phương pháp đo
quang phổ thông qua ion Cu2+ và Calcium pectate
Vỏ cây dâu t Vỏ cây dâu t
Kết quả được hiển thị trong bảng, có thể thấy rằng đối với các nguyên liệu thực vật khác nhau, phương pháp đo quang phổ thơng qua ion Cu2+ có sự khác biệt không đáng kể so với
phương pháp đo trọng lượng. RSD giữa chúng nằm trong khoảng 5.00% và giảm khi hàm
lượng pectin tăng lên. Kết luận, phương pháp đo quang phổ thơng qua ion Cu2+ có các ưu
điểm nổi trội, Do đó nó có thể được sử dụng rộng rãi trong việc xác định hàm lượng pectin của
nguyên liệu thực vật.
3.1.3. Năng lực của phương pháp Carbazole
Phương pháp Carbazole là một phương pháp cùng thời với phương pháp Calcium pectate, là một phương pháp xác định hàm lượng pectin dựa trên tổng khối lượng của D-
Galacturonic acid bằng phương pháp đo quang phổ. Ưu điểm của phương pháp này so với
phương pháp Calcium pectate là dễ thực hiện hơn và ít tốn thời gian hơn, đồng thời chúng mang
phương pháp này được làm rõ trong một thí nghiệm đo quang phổ thực hiện lần lượt trong hai điều kiện (100℃ trong 10 phút) và (85℃ trong 5 phút), từ đó ta có thể xác minh tính chính xác và độ tin cậy của phương pháp này, kết quả được thể hiện trong hai đồ thị đường thằng hồi quy tuyến tính sau.
19
Hình 14. Cường độ hấp thụ của D-Galacturonic acid khi thực hiện thí nghiệm ở 100℃ trong 10
phút
Hình 15. Cường độ hấp thụ của D-Galacturonic acid khi thực hiện thí nghiệm ở 85℃ trong 5
phút
Phương pháp Carbazole trong 2 thử nghiệm đều có hệ số tương quan R > 0.95, từ đây ta có thể kết luận độ chính xác của phương pháp Carbazole là tương đối cao. Tuy nhiên cả 2 đồ thị đều không thể đạt hệ số tương quan tới R = 0.999 như phương pháp đo quang phổ ion Cu2+ hoặc R = 1 (đường chuẩn có ý nghĩa cao nhất), điều này có thể được giải thích là do màu sắc của phương pháp Carbazole thu được không những phụ thuộc vào nồng độ của D-Galacturonic acid mà còn phụ thuộc vào các phân tử khác như D-Galatose, L-Rhamnose là 2 phân tử có độ hấp thu quang hồn tồn khác nhau (D-Galacturonic acid chỉ chiếm tối thiểu 80% trong cấu trúc của pectin trong mẫu thực phẩm). Ngoài ra, sự hiện diện của các carbohydrate như tinh bột, cellulose và đường trung tính trong dịch chiết pectin có thể gây ra sai số trong việc phân tích D-Galacturonic acid, vì carbazole có thể kết hợp bất kỳ phân tử đường trung tính nào có mặt để hình thành màu bổ sung, dẫn đến giá trị cường độ hấp thu xảy ra sai lệch lớn.
Khuyết điểm lớn thứ hai của phương pháp này là phương pháp Carbazole không thể xác định hàm lượng pectin đối với mẫu pectin có θ (hệ số thực nghiệm) chưa xác định được, có nghĩa là phương pháp này chỉ có phạm vi áp dụng đối với các loại thực phẩm đã có chính xác hệ số thực nghiệm rồi (ví dụ: cam, chanh dây…).
3.2. Kết luận
Phương pháp Calcium pectate tính tới thời điểm hiện tại vẫn là một trong những phương pháp xác định hàm lượng pectin có độ chính xác cao nhất, đi cùng với một số ưu điểm khác như: dễ thực hiện, tính sẵn có của thiết bị và thuốc thử và ưu điểm lớn nhất là phạm vi áp dụng rộng rãi đối với các loại thực phẩm
20
cũng như là sự khác nhau về địa lý vùng miền. Tuy nhiên, khuyết điểm lớn nhất của phương pháp này là tốn nhiều thời gian.
Để bù đắp khuyết điểm trên, một phương pháp sinh cùng thời đại với Calcium pectate là phương pháp Carbazole, tuy nhiên nhược điểm lớn nhất của Carbazole cũng như các phương pháp đo quang phổ khác đó chính là phạm vi áp dụng của phương pháp do có sự thiếu sót của hệ số thực nghiệm. Ngồi ra, độ chính xác của phương pháp này thấp hơn so với phương pháp Calcium pectate.
Kết hợp với cả ưu, nhược điểm của cả 2 phương pháp trên, một bước tiến mới được ra đời ở Trung Quốc vào năm 2021 là phương pháp đo quang phổ ion Cu2+. Phương pháp này giúp xác định gián tiếp hàm lượng pectin thông qua đo quang phổ hấp thu của Cu2+. Ưu điểm nổi trội của phương pháp này là độ chính xác vơ cùng cao (gần như là ngang ngửa với Calcium pectate) đi cùng với thời gian thí nghiệm ngắn và phạm vi áp dụng rộng đối với các mẫu trái cây khác nhau. Ngược lại, nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là đòi hỏi thiết bị hiện đại. Tuy nhiên phương pháp đo quang phổ ion Cu2+ đã chứng minh được giá trị của phương pháp và rất có tiềm năng trong tương lai sau này trong giới khoa học nghiên cứu.
21
KẾT LUẬN
Ứng dụng của polymer tự nhiên trong ngành công nghiệp thực phẩm đang tăng lên từng ngày. Các nhà nghiên cứu đang ngày càng tập trung nhiều hơn vào pectin vì tính dễ kiếm, tính linh hoạt về cấu trúc và thành phần linh hoạt. Pectin là một phụ gia được sử dụng trong thực phẩm như một chất kết dính, đặc biệt là trong mứt và thạch rau câu. Nó là sự lựa chọn ưu tiên của hầu hết các nhà chế biến thực phẩm như là chất thay thế chất béo hoặc đường trong các loại thực phẩm ít calo. Pectin khơng chỉ là chất điều chỉnh
– mà cịn là chất xơ có nhiều lợi ích, hịa tan trong nước, giúp giảm cholesterol và tăng cường sức khỏe tiêu hóa. Là một chất xơ hịa tan, pectin có khả năng liên kết với các chất béo trong đường tiêu hóa, bao gồm cholesterol và độc tố giúp thúc đẩy quá trình loại bỏ chúng ra khỏi cơ thể. Điều này có nghĩa là pectin có lợi cho việc giải độc của cơ thể, giúp điều chỉnh việc sử dụng đường và cholesterol của cơ thể, đồng thời cải thiện đường ruột và sức khỏe tiêu hóa. Trong những năm gần đây, nhu cầu tiêu thụ thực phẩm chế biến sẵn, trái cây tươi và rau quả ngày càng tăng đã mở ra một thị trường mới cho các loại màng ăn được nhờ vào khả năng phân hủy sinh học và tái chế. Các ứng dụng của pectin đã được làm rõ trong bài tiểu luận.
Bên cạnh đó, nhóm đã làm rõ các vấn đề đặt ra của bài tiểu luận như giới thiệu về cấu trúc, nguồn gốc và phân loại pectin, tính chất hóa học, hóa lý và những phương pháp chiết xuất và xác định hàm lượng pectin trong mẫu thực phẩm. Từ đó phân tích rõ ưu nhược điểm của từng phương pháp và ứng dụng thực tế của chúng trong khoa học thực tiễn. Qua đó giúp người phân tích có thể lựa chọn được phương pháp phân tích tối ưu nhất dựa vào đặc tính của ngun liệu cũng như tính sẵn có của thiết bị.
22
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Arash Jahandideh, Mojdeh Ashkani, Nasrin Moini. (2021). Biopolymers and their Industrial
Applications. Elsevier. pp. 193-218.
Truy cập từ https://doi.org/10.1016/C2018-0-05189-0
[2]Belkheiri, A.; Forouhar, A.; Ursu, A.V.; Dubessay, P.; Pierre, G.; Delattre, C.; Djelveh, G.; Abdelkafi, S.; Hamdami, N.; Michaud, P. (2021). Extraction, Characterization, and Applications of Pectins from
Plant By-Products. Appl. Sci.
Truy cập từ https://doi.org/10.3390/app11146596
[3] Devi, Nirmala & Deka, Chayanika & Maji, Tarun & Kakati, Dilip. (2016). Gelatin and Gelatin-
Polyelectrolyte Complexes: Drug Delivery.
Truy cập từ https://doi:10.1081/E-EBPP-120049954
[4] ED Ngouémazong, Christiaens S, Shpigelman A, Van Loey AM, Hendrickx ME. (2015). The
emulsifying and emulsion-stabilizing properties of pectin: A review. Comprehensive Reviews in Food
Science and Food Safety.
Truy cập từ https://doi:10.1111/1541-4337.12160
[5]Erumalla Venkatanagaraju, N. Bharathi, Rachiraju Hema Sindhuja, Rajshree Roy Chowdhury, Yarram Sreelekha. (01/2020). Extraction and Purification of Pectin from Agro-Industrial Wastes. IntechOpen Book Series.
Truy cập từ https://doi:10.5772/intechopen.85585
[6] Florina Dranca, Mircea Oroian. (2018). Extraction, purification and characterization of pectin from
alternative sources with potential technological applications. Food Research International. Volume 113.
pp. 327-350.
Truy cập từ https://doi:10.1016/j.foodres.2018.06.065
[7]Ghodsi Mohammadi Ziarani, Razieh Moradi, Negar Lashgari, Hendrik G. Kruger. (2018). Metal-Free
Synthetic Organic Dyes. Elsevier. Chapter 6 - Carbazole Dyes. pp. 109-116.
Truy cập từ https://doi.org/10.1016/C2017-0-03672-8
[8] Gowda, D. & Manjunath, M. & Anjali, & Kumar, Praveen & Srivastava, Atul & Osmani, Riyaz & Shinde, Chetan & Hatna, Siddaramaiah. (2016). Guar Gum and Its Pharmaceutical and Biomedical
Applications. Advanced Science, Engineering and Medicine.
Truy cập từ https://doi:10.1166/asem.2016.1874
23
[9] Marie Carene Nancy Picot-Allain, Brinda Ramasawmy & Mohammad Naushad Emmambux (2020):
Extraction, Characterisation, and Application of Pectin from Tropical and SubTropical Fruits: A Review.
Food Reviews International.
Truy cập từ: https://doi.org/10.1080/87559129.2020.1733008
[10] M. Abid, S. Cheikhrouhou, C.M.G.C. Renard, S. Bureau, G. Cuvelier, H. Attia, M.A. Ayadi. (2017).
Characterization of pectins extracted from pomegranate peel and their gelling properties. Food Chemistry.
pp. 318-325.
Truy cập từ https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2016.07.181
[11] Mohamed H. (2016). Extraction and characterization of pectin from grapefruit peels. MOJ Food Process Technol. pp. 31-38.