Công thức phân tử của đồng pectate là C17H22O16Cu, trong đó Cu chiếm 11,72% khối lượng của đồng pectate. Do đó, hàm lượng đồng pectate có thể được tính bằng cách đo hàm lượng Cu2+, có thể tính bằng cách đo hàm lượng Cu2+ trong dịch lọc.
Hình 12. Phương trình phản ứng của Pectin và Cu2+ 2.2.2.2. Ứng dụng
Phương pháp đo quang phổ thông qua ion Cu2+ là một phương pháp mới dùng để xác định hàm lượng pectin trong mẫu thực phẩm bằng phương pháp gián tiếp thông qua ion Cu2+. Phạm vi ứng dụng của phương pháp này tương đương với phương pháp Calcium pectate.
2.2.2.3. Chuẩn bị
✓ Hóa chất: Do quy trình thí nghiệm được thực hiện ở Trung Quốc nên các hóa chất và thuốc
thử sẽ
được sử dụng ở những công ty thương mại ở Trung Quốc bao gồm: NH3.H2O NaOH CH3COOH
CuCl2 Na2CO3 NaHCO3
✓ Thiết bị
- Tủ sấy DHG - 9070.
- Quang phổ kế FT-IR FTIR: Nicolet IS50.
- Máy Electron - Thermostatic Water Bath HH - 6.
- Máy quang phổ UV-Vis: UV-1900, Shimadzu, Japan.
2.2.2.4. Cách tiến hành
✓ Thiết lập đường cong làm việc của Cu2+
Bước 1: Lấy 2mL dung dịch CuCl2 ở các nồng độ khác nhau từ 3 tới 10.5 mmol/L cho vào bình định mức
10mL có chứa dung dịch đệm tương ứng sau đó chuyển vào cuvette thạch anh và sử dụng dung dịch đệm làm mẫu trắng.
Bước 2: Xác định độ hấp thụ của hỗn hợp ở bước sóng 712 nm bằng máy quang phổ UV-Vis.
Bước 3: Dựng một đường chuẩn tuyến tính được thiết lập giữa độ hấp thụ và hàm lượng của Cu2+. Ta sẽ đo trong một số điều kiện như sau:
-Thực hiện ở nhiệt độ phịng.
-Bước sóng xác định ở 712 nm.
- Thời gian phản ứng: hơn 30s do cần tối thiểu 30s để ion Cu2+ chuyển hóa hồn tồn thành Cu2(OH)2CO3.
Đường cong làm việc của mối quan hệ giữa nồng độ Cu2+ và độ hấp thụ ở bước sóng 712nm được biểu diễn như sau:
A = −0.00165 (±0.00534) + 73.2682 (±0.778) × C R2 = 0.999
Trong đó: C là nồng độ của Cu2+ trong hệ (mol/L)
A là độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 712 nm.
Hình 13. Đường chuẩn giữa nồng độ Cu2+ và độ hấp thụ ở bước sóng 712 nm
✓ Xác định hàm lượng Pectin
Lấy 2mL dịch lọc của mẫu thử (chứa pectin), thêm vào 10mL bình định mức, trong đó có 8mL dung dịch đệm. Sau khi trộn đều, hỗn hợp được chuyển sang cuvette thạch anh và đo độ hấp thụ ở bước sóng 712 nm trong máy quang phổ UV-vis để xác định hàm lượng Cu2+ trong dịch lọc, tiếp tục có thể sử dụng để tính hàm lượng pectin.
2.2.2.5. Tính tốn kết quả
Cơng thức tính hàm lượng pectin như sau:
( 0 − C × × 10−3) × 64
X = 0.1172 × 0 × (100 − ) × 103 × 100%
Trong đó: X là hàm lượng pectin (%)
C là nồng độ Cu2+ theo đường cong làm việc (mmol/L)
n0 là hàm lượng Cu2+ trước phản ứng (mmol)
V là tổng thể tích của dịch lọc (mL) 64 là khối lượng nguyên tử của đồng
0.1172 là tỷ lệ số nguyên tử đồng trong pectate đồng
m0 là khối lượng của mẫu (g)
W là độ ẩm của mẫu (%)
2.2.3. Phương pháp so màu Carbazole2.2.3.1. Giới thiệu 2.2.3.1. Giới thiệu
Phương pháp Carbazole: là phương pháp phân tích đo quang phổ pectin lần đầu được đề xuất bởi Dische (1946), bao gồm các bước chiết tách pectin từ thịt quả rau củ, depolymer pectin bằng acid sulfuric, phản ứng tạo màu với carbazole và đo quang phổ.
2.2.3.2. Nguyên tắc
Carbazole là một hydrocarbon thơm đa vòng gồm hai vòng benzen sáu cạnh được hợp nhất ở hai bên của một vòng chứa nitơ năm cạnh. Carbazole thường được ứng dụng như cầu liên hợp π để tạo ra thuốc nhuộm hữu cơ. Phản ứng tạo màu dựa trên phản ứng màu giữa các sản phẩm phân hủy của quá trình thủy phân pectin bằng acid đậm đặc với carbazole. Màu sắc thu được tỷ lệ thuận với nồng độ của galacturonic acid.
2.2.3.3. Ứng dụng
Phương pháp so màu Carbazole thường được sử dụng để xác định hàm lượng pectin trong trái cây và rau củ như đào, cà rốt, cam, chanh và cà chua. Trong những năm gần đây, phản ứng tạo màu của carbazole được sử dụng để xác định hàm lượng galacturonic acid của các polysaccharides trong phế phẩm nông nghiệp như vỏ bưởi, vỏ thanh long.
2.2.3.4. Chuẩn bị
✓ Hóa chất
Pectin Ethanol 95% và 63%
Thuốc thử Carbazole 0.1% Sulfuric acid đậm đặc
✓ Dụng cụ - Thiết bị Erlen 100mL Beaker 100mL Ống nghiệm Pipette Syringe
2.2.3.5. Cách tiến hành
✓ Pha thuốc thử Carbazole 0.1%
Hịa tan 0.1g carbazole bằng ethanol trong bình định mức đến vạch 100ml, lắc đều cho đến khi tan
hoàn toàn.
Bước 1: Cân mẫu pectin bằng cân phân tích.
Bước 2: Kết tủa mẫu pectin với lần lượt ethanol 95% và 63%. Sau đó, sấy khơ kết tủa và pha
lỗng mẫu bằng nước cất đến nồng độ 0.025%.
Bước 3: Cho 0.5mL thuốc thử carbazole 0.1% và 5 - 6mL sulfuric acid đậm đặc vào ống nghiệm
nhanh chóng trong 6s và lắc đều.
Bước 4: Đun nóng ống nghiệm đến 85 - 100℃ trong 5 - 10 phút. Bước 5: Làm nguội ống nghiệm trong bể đá trong 5 phút.
Bước 6: Cho lần lượt các mẫu vào lọ đựng bằng syringe để đo quang phổ. Độ hấp thụ được
đo bằng máy quang phổ chùm tia đôi 525nm sử dụng cuvette 1 cm.
Bước 7: Phép đo được thực hiện song song đối với mẫu trắng bao gồm 1ml nước cất, 0.5mL
thuốc thử carbazole 0.1% và 5 - 6mL sulfuric acid đậm đặc.
Lặp lại tương tự trong 3 lần.
2.2.3.6. Tính tốn kết quả
Định lượng pectin trong mẫu cần xác định bằng phương trình Lambert-Beer:
= × ×
Trong đó: A: Độ hấp thụ
ε: Độ hấp thụ mol (LM-1cm-1)
b: Chiều dày cuvette (cm) Cx: Nồng độ mẫu (mol/L)
Khi dung dịch cần xác định và dung dịch chuẩn có cùng chiều dày cuvette, ta có cơng thức:
b = const ⇒ Cx A X × ε
acid D−Galactu ronic
= Aacid D−Galacturonic × εX × Cacid D−Galacturonic
✓ Khối lượng acid D-Galacturonic trong mẫu được tính theo cơng thức như sau:
✓
macid D−Galacturonic = M × Cx × Vx
AX × εa cid D−Ga la ctu ron ic
= Aacid D−Galacturonic × εX × Cacid D−Galacturonic× Vx× M
16
✓Hàm lượng acid D-Galacturonic trong mẫu được tính theo cơng thức sau:
%D
%D − Galacturonic acid
Trong thế kỷ XIX, khi mà kiến thức về pectin của các loại thực phẩm vẫn chưa được khám phá và mở rộng như bây giờ, các nhà khoa học lúc bấy giờ cho rằng tổng hàm lượng đơn phân D-Galacturonic acid cũng chính là tổng khối lượng pectin trong thực phẩm, do đó hàm lượng D-Galacturonic acid trong thực phẩm cũng chính là hàm lượng pectin trong mẫu thực phẩm. Tuy nhiên, hiện nay người ta đã phát hiện rằng tổng khối lượng D-Galacturonic acid chỉ chiếm tối thiểu 80% trong thực phẩm (không đạt tới 100%) phụ thuộc vào bản chất loại thực phẩm. Do đó cơng thức trên chưa hồn tồn chính xác. Để phù hợp với thực tế, ta nên bổ sung cho công thức trên bằng một hệ số thực nghiệm θ (θ ≥ 80%) để tính chính xác hàm lượng pectin trong mẫu trái cây hoặc thực phẩm.
macid D−Galacturonic = mpectin × θ
%acid D − Galacturonic = %pectin × θ
17
CHƯƠNG 3. BÀN LUẬN VÀ KẾT LUẬN3.1. Bàn luận chung 3.1. Bàn luận chung
3.1.1. Năng lực của phương pháp Calcium pectate
Trong công nghệ thực phẩm, phương pháp Calciumum pectate là một trong những phương pháp xác định hàm lượng pectin được ưa chuộng nhất trên thế giới. Bởi vì phương pháp này có độ chính xác cao, tính lặp lại cao, chi phí thấp và ngồi ra cịn hạn chế sự ơ nhiễm mơi trường. Sau đây là một số nơi sử dụng phương pháp này với các phạm vi thực phẩm khác nhau ở Bảng 3:
Bảng 3. Hàm lượng pectin trong sương sáo Việt Nam
Sương sáo tươi Tiền Giang
Bảng 4. Hàm lượng pectin của các thành phần khác nhau bên trong mít ở Ấn Độ
Như ta đã thấy, hệ số biến thiên hàm lượng pectin của các thành phần sản phẩm thực phẩm là vô cùng thấp (thấp nhất là 0.10%, cao nhất là 0.16%), điều này cho thấy rằng phương pháp này có độ chính xác và độ lặp lại rất cao. Ngồi ra, ta thấy rằng phương pháp có tính phổ biến cao, sử dụng rộng rãi với hầu hết tất cả các loại thực phẩm với kết quả chính xác nhất bất kể là loại thực phẩm nào hoặc vùng địa hình địa lý nào. Phương pháp này hiện nay được coi là một trong những phương pháp xác định hàm lượng pectin mạnh nhất bây giờ.
3.1.2. Năng lực của phương pháp đo quang phổ thông qua ion Cu2+
Phương pháp đo quang phổ thông qua ion Cu2+ là một phương pháp xác định hàm lượng pectin trong thực phẩm xuất hiện trong năm 2021, được phát triển bởi nhóm nghiên cứu Trung Quốc nhằm cung cấp thêm phương pháp xác định hàm lượng pectin cũng như là đơn giản hóa quy trình nghiên cứu bằng cách sử dụng máy đo quang phổ. Mặc dù phương pháp này chưa được phổ biến và sử dụng rộng rãi trên thế giới nhưng đã chứng minh được tiềm năng trong tương lai và chứng minh được khả năng xác định hàm lượng pectin cịn chính xác hơn phương pháp Calcium pectate.
Để xác minh độ chính xác của phương pháp này, người ta phân tích độ lặp lại của phương pháp bằng cách tính độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của phép đo quang phổ ion Cu2+ trong 4 phép đo là 2.60%; 1.10%; 0.14%; 0.31% (<3%). Từ đó cho thấy rằng phương pháp này có độ lặp lại tốt và độ chính xác cao.
Ngồi ra, ta cũng sử dụng 4 mẫu có hàm lượng pectin khác nhau để thực hiện song song 2 phương pháp Calcium pectate và đo quang phổ ion Cu2+ để xác minh tính chính xác và độ tin cậy của phương pháp
đo quang phổ ion Cu2+ và kết quả được thể hiện trong bảng 1. Có thể thấy rằng hàm lượng pectin được
đo
bằng phương pháp này có kết quả chính xác hơn hoặc gần đúng với phương pháp Calcium pectate.
Bảng 5. Khối lượng pectin trong mẫu thực phẩm được xác định bằng 2 phương pháp đo quang phổ
thông qua ion Cu2+ và Calcium pectate
Mẫu
1 2 3 4
Để xác nhận tính phổ biến đối với các loại thực phẩm khác nhau, phương pháp đo quang phổ thông
qua ion Cu2+ và phương pháp Calcium pectate đã được sử dụng tương ứng để xác định hàm lượng pectin
của một số nguồn thực vật khác nhau. Vỏ của cây dâu tằm giấy, sợi dứa, và Chi Niệt dó được chọn làm nguyên liệu để phân tích.
Bảng 6. Khối lượng pectin trong các mẫu thực phẩm đa dạng bằng 2 phương pháp đo
quang phổ thông qua ion Cu2+ và Calcium pectate
Vỏ cây dâu t Vỏ cây dâu t
Kết quả được hiển thị trong bảng, có thể thấy rằng đối với các nguyên liệu thực vật khác nhau, phương pháp đo quang phổ thơng qua ion Cu2+ có sự khác biệt không đáng kể so với
phương pháp đo trọng lượng. RSD giữa chúng nằm trong khoảng 5.00% và giảm khi hàm
lượng pectin tăng lên. Kết luận, phương pháp đo quang phổ thơng qua ion Cu2+ có các ưu
điểm nổi trội, Do đó nó có thể được sử dụng rộng rãi trong việc xác định hàm lượng pectin của
nguyên liệu thực vật.
3.1.3. Năng lực của phương pháp Carbazole
Phương pháp Carbazole là một phương pháp cùng thời với phương pháp Calcium pectate, là một phương pháp xác định hàm lượng pectin dựa trên tổng khối lượng của D-
Galacturonic acid bằng phương pháp đo quang phổ. Ưu điểm của phương pháp này so với
phương pháp Calcium pectate là dễ thực hiện hơn và ít tốn thời gian hơn, đồng thời chúng mang
phương pháp này được làm rõ trong một thí nghiệm đo quang phổ thực hiện lần lượt trong hai điều kiện (100℃ trong 10 phút) và (85℃ trong 5 phút), từ đó ta có thể xác minh tính chính xác và độ tin cậy của phương pháp này, kết quả được thể hiện trong hai đồ thị đường thằng hồi quy tuyến tính sau.
19
Hình 14. Cường độ hấp thụ của D-Galacturonic acid khi thực hiện thí nghiệm ở 100℃ trong 10
phút
Hình 15. Cường độ hấp thụ của D-Galacturonic acid khi thực hiện thí nghiệm ở 85℃ trong 5
phút
Phương pháp Carbazole trong 2 thử nghiệm đều có hệ số tương quan R > 0.95, từ đây ta có thể kết luận độ chính xác của phương pháp Carbazole là tương đối cao. Tuy nhiên cả 2 đồ thị đều không thể đạt hệ số tương quan tới R = 0.999 như phương pháp đo quang phổ ion Cu2+ hoặc R = 1 (đường chuẩn có ý nghĩa cao nhất), điều này có thể được giải thích là do màu sắc của phương pháp Carbazole thu được không những phụ thuộc vào nồng độ của D-Galacturonic acid mà còn phụ thuộc vào các phân tử khác như D-Galatose, L-Rhamnose là 2 phân tử có độ hấp thu quang hồn tồn khác nhau (D-Galacturonic acid chỉ chiếm tối thiểu 80% trong cấu trúc của pectin trong mẫu thực phẩm). Ngoài ra, sự hiện diện của các carbohydrate như tinh bột, cellulose và đường trung tính trong dịch chiết pectin có thể gây ra sai số trong việc phân tích D-Galacturonic acid, vì carbazole có thể kết hợp bất kỳ phân tử đường trung tính nào có mặt để hình thành màu bổ sung, dẫn đến giá trị cường độ hấp thu xảy ra sai lệch lớn.
Khuyết điểm lớn thứ hai của phương pháp này là phương pháp Carbazole không thể xác định hàm lượng pectin đối với mẫu pectin có θ (hệ số thực nghiệm) chưa xác định được, có nghĩa là phương pháp này chỉ có phạm vi áp dụng đối với các loại thực phẩm đã có chính xác hệ số thực nghiệm rồi (ví dụ: cam, chanh dây…).
3.2. Kết luận
Phương pháp Calcium pectate tính tới thời điểm hiện tại vẫn là một trong những phương pháp xác định hàm lượng pectin có độ chính xác cao nhất, đi cùng với một số ưu điểm khác như: dễ thực hiện, tính sẵn có của thiết bị và thuốc thử và ưu điểm lớn nhất là phạm vi áp dụng rộng rãi đối với các loại thực phẩm
20
cũng như là sự khác nhau về địa lý vùng miền. Tuy nhiên, khuyết điểm lớn nhất của phương pháp này là tốn nhiều thời gian.
Để bù đắp khuyết điểm trên, một phương pháp sinh cùng thời đại với Calcium pectate là phương pháp Carbazole, tuy nhiên nhược điểm lớn nhất của Carbazole cũng như các phương pháp đo quang phổ khác đó chính là phạm vi áp dụng của phương pháp do có sự thiếu sót của hệ số thực nghiệm. Ngồi ra, độ chính xác của phương pháp này thấp hơn so với phương pháp Calcium pectate.
Kết hợp với cả ưu, nhược điểm của cả 2 phương pháp trên, một bước tiến mới được ra đời ở Trung Quốc vào năm 2021 là phương pháp đo quang phổ ion Cu2+. Phương pháp này giúp xác định gián tiếp hàm lượng pectin thông qua đo quang phổ hấp thu của Cu2+. Ưu điểm nổi trội của phương pháp này là độ chính xác vơ cùng cao (gần như là ngang ngửa với Calcium pectate) đi cùng với thời gian thí nghiệm ngắn và phạm vi áp dụng rộng đối với các mẫu trái cây khác nhau. Ngược lại, nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là đòi hỏi thiết bị hiện đại. Tuy nhiên phương pháp đo quang phổ ion Cu2+ đã chứng minh được giá trị của phương pháp và rất có tiềm năng trong tương lai sau này trong giới khoa học nghiên cứu.
21
KẾT LUẬN
Ứng dụng của polymer tự nhiên trong ngành công nghiệp thực phẩm đang tăng lên từng ngày. Các nhà nghiên cứu đang ngày càng tập trung nhiều hơn vào pectin vì tính dễ kiếm, tính linh hoạt về cấu trúc và thành phần linh hoạt. Pectin là một phụ gia được sử dụng trong thực phẩm như một chất kết dính, đặc biệt là trong mứt và thạch rau câu. Nó là sự lựa chọn ưu tiên của hầu hết các nhà chế biến thực phẩm như