CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3. CHỨC NĂNG HÓA BỀ MẶT HẠT NANO TỪ, GẮN KẾT VÀ LÀM
GIÀU TẾ BÀO VI KHUẨN LAO
1.3.1. Chức năng hóa bề mặt hạt nano từ
Hạt nano từ tính có kích thƣớc 10 nm – 20 nm đƣợc chế tạo bằng phƣơng pháp đồng kết tủa hai ion Fe3+
và Fe2+ bằng OH- tại nhiệt độ phòng hoặc tại 90oC trong mơi trƣờng khí N2 để tránh oxi hóa. Phép đo quang phổ kế hồng ngoại cho thấy trên bề mặt hạt nano từ tính trong nƣớc có bao phủ một lớp –OH, đây là một nhóm chức
quan trọng trong việc tạo liên kết với các chất hoạt hóa bề mặt cần thiết cho các ứng dụng sinh học [14, 15]
Để có thể ứng dụng trong sinh học, các hạt nano cần phải đƣợc chức năng hóa bề mặt để gắn kết với các đối tƣợng sinh học nhƣ ADN, kháng thể, enzyme. Các nhóm chức thƣờng gặp là nhóm amine, biotin, streptavidin, carboxyl, thiol. Để có đƣợc các nhóm chức trên bề mặt hạt nano, ngƣời ta sử dụng nguyên tắc thủy phân organosilane để tạo ra một lớp polymer trên bề mặt hạt nano [6, 32].
Organosilane là các phân tử có hai nhóm chức có cơng thức tổng quát là X-(CH2)n-SiRn(OR’)3-n. Trong đó thì X là nhóm chức cần thiết để có thể gắn kết với các đối tƣợng sinh học, (CH2)n là nhóm đệm hữu cơ, phụ thuộc vào n mà lớp đệm này có thể dày hay mỏng. SiRn là nhóm liên kết với nhóm hydroxyl của bề mặt hạt nano.
Alkoxysilane với rất nhiều nhóm chức X khác nhau đã đƣợc thƣơng mại hóa. Trong quá trình chức năng hóa bề mặt, với phân tử organosilane, xảy ra hai phản ứng đồng thời, đó là q trình thủy phân các nhóm silane alkoxy n thành các nhóm silanol hoạt tính và q trình hóa rắn của các silanol với nhóm hydroxyl tự do trên bề mặt của hạt nano từ tính Fe3O4 để tạo ra các liên kết Si-O-Si bền vững. Điều kiện của môi trƣờng phản ứng có ảnh hƣởng rất nhiều đến quá trình chức năng hóa bề mặt. Ví dụ nhƣ ethanol thì thƣờng làm gia tăng quá trình thủy phân và động học hóa rắn do đó làm tăng cƣờng q trình chức năng hóa bề mặt, tuy nhiên cồn cũng cạnh tranh với nhóm silane trên bề mặt bằng liên kết hydro.
Có rất nhiều các nhóm chức khác nhau đƣợc tạo ra tùy theo mục đích thực nghiệm và trong số đó thì nhóm amine đƣợc sử dụng nhiều nhất trong các ứng dụng sinh học. Hạt nano từ tính có nhóm amine (NP-NH2) thƣờng đƣợc tạo ra bằng cách sử dụng 3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) [15, 34]
Hình 1.5. Hạt nano từ tính Fe3O4 đƣợc chức năng hóa bề mặt bằng nhóm amine sử dụng APTS [34]
1.3.2. Quá trình gắn kết hạt nano từ với kháng thể kháng lao
Phức hợp hạt nano từ với kháng thể đặc hiệu có thể đƣợc tạo ra bởi nhiều cơ chế khác nhau. Theo các nhà nghiên cứu về lĩnh vực cơng nghệ nano thì hiện nay có nhiều cách để tạo ra phức hợp này là: gắn kết trực tiếp thông qua liên kết amine – carboxyl; sử dụng SMCC (Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane - 1- carboxylate) làm xúc tác tạo cặp sulfhydryl-amine; gắn kết trực tiếp thơng qua các nhóm carbohydrate bị oxy hóa trên phần Fc của kháng thể; gắn kết khơng hóa trị của hạt nano silica đƣợc bọc streptavidin với các kháng thể đƣợc biotin hóa... Mỗi kiểu gắn kết có những ƣu điểm và hạn chế riêng. Nhƣng nhìn chung, nếu có từ 1 đến 3 cầu nối trung gian giữa kháng thể và hạt nano từ thì càng làm cho phức hợp bền vững hơn và kháng thể khơng mất hoạt tính lâu hơn [10, 20].
Trong các cách tạo liên kết kể trên thì có thể nói việc gắn trực tiếp thông qua liên kết amine – carboxyl là đơn giản nhƣng cũng đem lại hiệu quả khá cao. Hạt từ amine ban đầu có thể kết hợp với một số hợp chất nhƣ các hợp chất chứa aldehyde,
các glycoprotein đã bị oxy hóa hay các hợp chất hoạt hóa este nhóm N-hydroxysuccinimide (NHS) hoặc các hợp chất biến đổi từ Iodoacetyl. Tuy nhiên
hiện nay cách mà có nhiều ƣu điểm hơn cả đó là việc sử dụng gắn trực tiếp hạt từ amine với hợp chất chứa nhóm carboxyl thơng qua cầu nối trung gian 1-ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride.
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride hay EDC hoặc EDAC là hợp chất carbodiimide phổ biến nhất đƣợc sử dụng để tạo cầu nối giữa nhóm amine và nhóm carboxyl. EDC là một chất tan trong nƣớc, hoạt động tốt trong khoảng pH 4,5 và pH 7,5. EDC cũng thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với NHS hoặc sulfo-NHS để tăng hiệu qủa gắn kết hoặc tạo ra một sản phẩm amine phản ứng ổn định [20]. Việc gắn kết giữa hạt từ amin với kháng thể thông qua cầu nối trung gian EDC đƣợc thực hiện qua hai bƣớc nhƣ mơ tả tại hình 1.6. Hạt từ amine sẽ phản ứng với EDC tạo ra một chất trung gian không bền (A), hợp chất này ngay lập tức sẽ gắn kết với kháng thể thơng qua liên kết giữa nhóm amine với carboxyl tạo thành sản phẩm bền vững và phản ứng ổn định (B).
1.3.3. Làm giàu tế bào vi khuẩn lao bằng từ trƣờng
Nhóm chức đƣợc chức năng hóa trên bề mặt khơng những có thể tạo liên kết với một vị trí nào đó trên bề mặt tế bào hoặc phân tử mà còn giúp cho các hạt nano phân tán tốt trong dung mơi, tăng tính ổn định của chất lỏng từ. Giống nhƣ trong hệ miễn dịch, vị trí liên kết đặc biệt trên bề mặt tế bào sẽ đƣợc các kháng thể hoặc các phân tử khác nhƣ các hormone, acid folic nhận biết. Các kháng thể sẽ liên kết với các kháng nguyên. Đây là cách rất hiệu quả và chính xác để đánh dấu tế bào. Các hạt từ tính đƣợc bao phủ bởi các chất hoạt hóa tƣơng tự các phân tử trong hệ miễn dịch nên có thể tạo ra các liên kết với các tế bào hồng cầu, tế bào ung thƣ phổi, vi khuẩn, tế bào ung thƣ đƣờng tiết niệu và thể golgi. Đối với các tế bào lớn, kích thƣớc của các hạt từ đơi lúc cũng cần phải lớn, có thể đạt kích thƣớc vài trăm nm [27].
Q trình chọn lọc và làm giàu tế bào đƣợc thực hiện nhờ một gradient từ trƣờng ngoài. Từ trƣờng ngoài tạo một lực hút các hạt từ tính có mang các tế bào đƣợc đánh dấu. Các tế bào không đƣợc đánh dấu sẽ không đƣợc giữ lại và thốt ra ngồi.
Hình 1.7. Nguyên tắc chọn lọc và làm giàu tế bào bằng từ trƣờng [6]
(a) Nam châm được đặt bên ngoài để hút các tế bào đã được đánh dấu và loại bỏ các tế bào không được đánh dấu; (b) Nam châm có thể đặt vào một dịng chảy có chứa tế bào cần chọn lọc