Lấy ống nghiệm còn lại (ống thứ 11) cho vào 3 ml nước cất, 2 giọt thuốc thử Iodine trong KI, so sánh màu của 10 ống nghiệm trên để xác định ống có nồng độ enzym thấp nhất thủy phân hồn toàn tinh bột thành dextrin.
Lượng enzyme được cho vào ống nghiệm (1): n = m.VV21
Trong đó:
V1- Thể tích dịch chiết enzyme cho vào ống nghiệm (1) (1ml) V2- Thể tích dịch chiết enzyme (100 ml )
m- Lượng mẫu cân vật phẩm chứa enzyme (mg) Một đơn vị Wohlgemuth (W):
W = Fn.5
Trong đó :
F- Độ pha lỗng của ống nghiệm có nồng độ enzyme nhỏ nhất thủy phân hoàn toàn tinh bột ( ống nghiệm có màu trùng với màu của ống nghiệm 11)
Số đơn vị Wohlgemuth có trong 1 ml dịch chiết enzym ( NW): Nw = V1n.W
2 Xác định hoạt độ lipase2.1 Nguyên tắc 2.1 Nguyên tắc
Dưới tác dụng của lipase, lipid bị thủy phân và giải phóng acid béo.Hàm lượng acid được chuẩn độ bằng kiềm.Hoạt độ của enzyme là lượng kiềm cần để trung hịa acid mới được hình thành.Cơ chất tốt nhất đối với lipase chính là lipid của cùng một đối tượng enzyme.
Hóa chất
Đệm acetate pH=4,7 (trộn CH3COOH 1N và CH3COONa 1N theo tỉ lệ 1:1), cồn 960, toluen, ether ethylic, NaOH 0.1 N, Phenolphthalein 1%: 1.0g phenolphtalein được pha với 50 ml ethanol và 50 ml nước cất. Dầu đậu nành tinh khiết.
Cân 5g hạt đậu nành, nghiền thành bột mịn bằng cối sứ. Chuyển vào erlen, thêm 10ml nước cất, lắc đều trong 15 phút ở 30oC.
Cho thêm vào 1ml dầu đậu nành làm cơ chất và 5 ml đệm acetate với vài giọt toluene, lắc đều hỗn hợp ở 30oC trong 24 giờ. Khi hết thời gian phản ứng, cho vào mỗi bình 25ml cồn 96o và 15ml ether, lắc đều và để yên 2 phút.
Chuẩn độ dung dịch bằng NaOH 0,1N với chỉ thị phenolphthalein 1%.
Lặp lại thí nghiệm 3 lần.Làm bình kiểm chứng tương tự như trên nhưng dịch chiết enzyme phải được đun cách thủy 10 phút để làm mất hoạt tính trước khi cho cơ chất vào.
2.2 Tính kết quả
Hoạt độ của lipase được biểu thị bằng số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ lượng acid tự do sinh ra do lipase trích từ 10g hạt thủy phân trong 24 giờ :
X = (a−b)m.10. k
Trong đó:
a : số ml NaOH dùng để chuẩn độ trong bình thí nghiệm b : số ml NaOH dùng để chuẩn độ trong bình kiểm chứng k : hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0,1 N
m : khối lượng hạt sử dụng
3 Khảo sát hoạt độ invertase3.1 Nguyên tắc 3.1 Nguyên tắc
Invertase là một enzyme thủy phân saccharose thành glucose và fructose.Dựa vào tính chất Iodine trong dung dịch kiềm có khả năng oxi hóa glucose để xác dịnh lượng glucose sinh ra bằng cách định phân Iodine dư với dung dịch Na2S2O3.
Hóa chất
• Saccharose 10%
cất.
• Iodine 0,1N: cân 40 g KI và hòa tan với 100 mL nước cất trong bình cầu 1000- ml. Cân 12.7 g I2 cho vào bình cầu trên và lắc cho đến khi tan hoàn toàn. Nhỏ 3 giọt 37% HCl. Định mức cho đủ 1000 ml bằng nước cất.
• H2SO4 1N: hòa tan 27.7 ml H2SO4 96% cho đủ 1000 ml bằng nước cất.
• Hồ tinh bột 1%: 1 g hồ tinh bột hòa tan trong 100 ml. Đun cách thủy trong 15 phút.
• Dung dịch Na2S2O3 0,05N: cân 12.5 g Na2S2O3.5H2O trong nước cất cho đủ 1000 ml.
3.2 Cách tiến hành
Điều chế dung dịch invertase: cân 1g men bánh mì, hịa tan vào 50ml nước cất, cho vào bình định mức 100ml, định mức tới vạch, lắc đều trong 5 phút. Để lắng, lọc lấy dịch lọc. Thực hiện 3 ống nghiệm như sau: