Đun sôi cách thủy các ống nghiệm trong 5 phút. Sau đó, làm nguội nhanh các ống nghiệm đến nhiệt độ phịng.
Đo mật độ quang ở bước sóng 540nm với các mẫu chuẩn và mẫu trắng bằng máy quang phổ so màu.
Xác định hàm lượng đường khử trong mẫu: lấy 1mL phần dịch trong cho vào ống nghiệm để xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp so màu. Tùy vào nồng độ đường khử có trong mẫu mà tiến hành pha lỗng mẫu hoặc chuẩn theo tỷ lệ thích hợp. Viết phương trình đường chuẩn: A = f(C), xác định hệ số tương quang R.
7.3 Tính kết quả
Dựa trên độ hấp thu đở ở bước sóng 540nm, ta có thể xác định hàm lượng đường khử có trong 1mL mẫu.Từ đó, ta có thể xác định hàm lượng đường khử trong nguyên liệu ban đầu (G, %w/w) theo công thức:
G (%) = X .f .Vdm100.m .100
X - nồng độ đường khử (theo glucose) trong dung dịch mẫu (mg/mL) F - hệ số pha lỗng từ bình định mức
Vđm - thể tích định mức dung dịch thí nghiệm m - khối lượng mẫu (g)
8. Xác định đường khử bằng phương pháp chuẩn độ oxi hóa khử với KALIFERRYCYANURE
8.1 Nguyên tắc:
Khi cho ferrycyanure K3Fe(CN)6 phản ứng với đường khử, sản phẩm thu được là ferrocyanure. Dựa vào phản ứng này, ta có thể suy ra lượng đường khử có mặt trong dung dịch cần xác định. Việc chuẩn độ được tiến hành trong mơi trường kiềm NaOH, khi đun nóng với chỉ thị xanh metylen (methylen blue).
Phương trình phản ứng:
Phương pháp này đơn giản hơn phương pháp dùng dung dịch kiềm của sulfat đồng do không tạo tủa và phản ứng kết thúc rõ ràng.Kết quả tính tốn khơng dựa vào phương trình lý thuyết, mà dùng cơng thức thực nghiệm.Độ chính xác của kết quả phụ thuộc nhiều yếu tố, nhưng trình tự tiến hành và thao tác là quan trọng nhất.
8.2 Quy trình thực hiện
Quy trình xử lý mẫu: tương tự như phương pháp Bertrand
Chuẩn độ xác định hàm lượng đường khử
Từ m gam (hoặc mL nếu mẫu lỏng) mẫu ban đầu, chúng ta tiến hành trích ly đường khử và định mức thành 100 mL (dung dịch chứa đường khử thô).Cho vào burette dung dịch mẫu chứa đường khử đã được lọc tách tạp chất.
Cho vào erlen 10mL dung dịch K3Fe(CN)61% và 2,5mL dung dịch NaOH 2,5N. Đun sôi và chuẩn độ ngay trên bếp bằng dung dịch đường khử hoặc đường tổng từ burette, cho từng giọt một, lắc mạnh.Dung dịch ban đầu có màu vàng chanh của ferrycyanure. Điểm dừng chuẩn độ xác định khi màu vàng chanh biến mất, dung dịch trong suốt không màu
trong khoảng 30 giây rồi chuyển sang màu vàng rơm rất nhạt của ferrocyanure. Trong trường hợp khó nhận điểm chuyển màu, có thể kiểm tra điểm kết thúc bằng cách nhỏ một giọt chỉ thị methylen blue và một giọt đường thừa đầu tiên sẽ làm mất màu xanh cho biết phản ứng đã kết thúc.
Lưu ý:
• Kết quả lần chuẩn độ đầu tiên chỉ có giá trị tham khảo cho lần chuẩn độ thứ hai. Lần này, sau khi đun sôi dung dịch ferrycyanure, xả nhanh lượng đường (theo kết quả lần chuẩn độ trước), chỉ để lại khoảng dưới 1mL để chuẩn độ tiếp tìm chính xác điểm cuối.
• Kết quả tính tốn chỉ sử dụng từ lần chuẩn độ thứ hai trở đi.
• Thí nghiệm tương tự đối với dung dịch đường chuẩn là dung dịch glucose 0,5%.
8.3 Tính tốn kết quả
Trong thí nghiệm, gọi Vk mL dung dịch mẫu và Vg mL dung dịch glucose 0,5% cùng phản ứng với một dung dịch ferrycyanure ở một nồng độ xác định. Như vậy, Vk mL dung dịch mẫu tương ứng với Vg mL dung dịch glucose 0,5% có (0,5 x Vg)/100 g glucose.
Lượng đường khử được tính bằng cơng thức:
Xk = 0,5100.Vg .V.Vk .m.100 Trong đó:
Xk– lượng đường khử, g/100g hay g/100mL
Vg– thể tích dung dịch glucose 0,5% cho chuẩn độ, mL Vk– thể tích dung dịch đường khử cho chuẩn độ, mL V – thể tích bình định mức, mL (100 mL)
PHẦN III: LIPID (CHẤT BÉO)
Lipid là dẫn xuất các acid béo cao phân tử và các alcohol.Lipid thường gặp là dầu thực vật và mỡ động vật.Ở động vật, lipid phân bố chủ yếu trong mơ mỡ, não, sữa…; cịn ở thực vật thường tập trung ở hạt (nành, phộng, oliu, hướng dương, cám,…).
Chất béo có thể hồ tan trong ether, chloroform, hoặc các dung mơi hữu cơ khác, khơng hịa tan trong nước.
Các phương pháp định lượng lipid:
1. Định lượng lipid tổng trong mẫu rắn bằng phương pháp Soxhlet1.1 Nguyên tắc 1.1 Nguyên tắc
Dùng dung mơi kỵ nước trích ly hồn toàn lipid từ nguyên liệu đã được nghiền nhỏ.Một số thành phần hịa tan trong chất béo cũng được trích ly theo bao gồm sắc tố, các vitamin tan trong chất béo, các chất mùi.Tuy nhiên, hàm lượng của chúng tương đối thấp. Do có lẫn tạp chất, phần trích ly được gọi là lipid tổng hay dầu thơ.
Hàm lượng lipid tổng có thể tính bằng cách cân trực tiếp lượng dầu sau khi chưng cất loại sạch dung mơi hoặc tính gián tiếp tư khối lượng bã cịn lại sau khi trích ly hồn tồn lipid bằng dung mơi.
1.2 Quy trình thực hiện:
Sấy khơ nguyên liệu đến khối lượng không đổi.Cân khoảng 5g nguyên liệu đã được nghiền nhỏ, cho vào túi giấy chuyên dùng cho bộ Soxhlet đã được sấy khô và biết khối lượng. Đặt túi giấy vào trụchiết.Lắp cốc chứa dung môi vào các vị trí cố định trên thiết bị. Mở van cho nước lạnh vào ống sinh hàn.Bất công tắc bộ gia nhiệt và điều chỉnh nhiệt độ trích ly. Q trình trích ly có thể tiến hành theo 2 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: nhúng toàn bộ trụ chiết chứa nguyên liệu vào cốc chứa dung môi, thời gian tiến hành là 2 – 3 giờ.
- Giai đoạn 2: kéo trụ chiết lên khỏi cốc dung mơi và tiếp tục trích ly bằng dung mơi đã hồn lưu.
Hình 5: Thiết bị chiết Soxhlet
1.3 Tính kết quả
Hàm lượng phần trăm chất béo tính theo cơng thức:
X = (M1– M2)*100/m Trong đó:
M1 là khối lượng túi giấy và mẫu ban đầu, g
M2: khối lượng túi giấy và mẫu sau khi trích lipid và sấy khô, g M: khối lượng mẫu ban đầu, g
2. Định lượng lipid tổng trong mẫu lỏng bằng phương pháp Adam Rose-Gottlieb 2.1 Nguyên tắc
Chất béo trong mẫu sữa được trích ly bằng cách bổ sung lần lược 4 dung môi khác nhau: amoniac, cồn, diethy ether và petroleum ether.Cồn và amoniac được dùng để kết tủa và loại protein ra khỏi các hạt cầu béo. Diethy ether được dùng để trích ly béo và các thành phần tan trong béo. Petroleum ether được bổ sung vào để trích ly béo và một lượng nhỏ các thành phần tan trong béo do petroleum ether là dung mơi trích ly có tính chọn lọc cao hơn so với diethyl ether.
Hỗn hợp sau khi bổ sung dung môi và khuấy đảo tách thành hai pha: pha nhẹ nằm ở trên gồm dung môi và béo, pha nặng nằm dưới gồm nước và các chất hòa tan trong nước. Ta thu pha nhẹ gồm dung môi và béo, làm bay hơi dung môi ta thu được tổng béo trong mẫu sữa.
Lấy 10mL dịch sữa cho vào erlen 250mL.Sau đó bổ sung lần lược 1.5 mL dung dịch NH3 và 10mL cồn.Lắc đều hỗn hợp trong 1 phút.Thêm từ từ 25mL diethy ether và lắc đều hỗn hợp trong 10 phút.Cuối cùng, 25mL diethy ether được bổ sung và hỗn hợp được lắc đều trong 10 phút.
Chuyển toàn bộ hỗn hợp sữa và dung môi vào phễu chiết.Tráng erlen bằng petroleum ether nhiều lần nhằm trích ly hết béo cịn sót lại trên thành erlen.Cho tồn bộ hỗn hợp này vào phễu chiết và để quá trình tách lớp diễn ra tự nhiên trong 30 phút.Hỗn hợp sẽ tách thành 2 pha. Pha nhẹ là hỗn hợp gồm dung môi diethy ether, petroleum ether và béo, pha nặng gồm protein kết tủa, cồn, NH3và các thành phần còn lại trong sữa. Thu pha nhẹ và cho vào đĩa petri. Đạt đĩa petri vào trong tủ hút cho đến khi dung mơi bay hơi gần hết, sau đó cho đĩa petri này vào tủ sấy đang ở chế độ sấy 102 ± 1 0C.Sấy đến khối lượng không đổi (khoảng 1h). Sau đó đĩa petri chứa béo được làm nguội về nhiệt độ phịng và cân định lượng.
2.3 Tính tốn kết quả
Hàm lượng chất béo có trong 100mL dịch sữa được tính theo cơng thức sau:
TF = (M−mv).100 Trong đó:
TF (total fat): hàm lượng béo trong 100mL dịch sữa(g/100mL) M: khối lượng đĩa petri và béo sau khi sấy
m: khối lượng đĩa petri ban đầu v: thể tích sữa đem phân tích (10mL)
3. Phương pháp Chloroform- Methanol3.1 Nguyên tắc 3.1 Nguyên tắc
Sử dụng methanol, chloroform hòa tan chất béo trong mẫu thực phẩm.Hỗn hợp mẫu và dung môi sẽ được tách thành hai lớp. Tách lấy lớp chất béo đem đi sấy khô đến khối lượng không đổi và đi cân định lượng.
Hóa chất:
+ Methanol + KCL 88 %
+ NaSO4
3.2 Quy trình thực hiện
• Trộn 1g mẫu và 10ml Methanol và đồng hóa bằng cấy đảo trộn trong 1 phút. • Bổ sung 20ml Chloroform và đồng hóa trong 2 phút.
• Lọc hỗn hợp qua giấy lọc ( dung mơi hịa tan chất béo hoặc xác chất rắn )
• Bổ sung dịch lọc với 30ml hỗn hợp Chloroform-Methanol với tỷ lệ 2:1 và lọc lần hai với giấy lọc.
• Xác định thể tích dịch lọc và bổ sung dung dịch KCL 0.88 % vào dịch lọc với thể tích bằng 25% thể tích dịch lọc.
• Lúc này, hỗn hợp tách làm hai lớp: lớp dưới là dung mơi hịa tan béo,lớp trên chứa KCL.Ta thu nhận lớp dung mơi hịa tan béo.
• Xác định thể tích dịch trích và bổ sung nước với thể tích bằng 25% thể tích dịch trích. • Bổ sung Na2SO4 vào hỗn hợp để loại nước.lọc hỗn hợp qua giấy lọc, . Sử dụng
chloroform để rửa natri sunfat trên giấy lọc.
Đặt hỗn hợp chloroform - lipid trong một bình đáy trịn và loại bỏ chloroform từ lipid bằng cách sử dụng một thiết bị bay hơi quay với nhiệt độ nước dưới 50°C, ta thu được lượng lipid trong mẫu.
4. Phương pháp Babcook.4.1 Nguyên tắc 4.1 Nguyên tắc
Sử dụng H2SO4 để kết tủa protein, tạo ra nhiệt và giải phóng chất béo => hỗn hợp tự tách làm hai lớp: lớp trên là chất béo, lớp dưới là những chất hào tan => đo thể tích lớp trên chứa chất béo => % chất béo trong hỗn hợp.
4.2 Quy trình:
• Cho mẫu vào chai badcook và cho acid vào,cho phép acid chạy nhẹ nhàng xuống cổ chai,acid sẽ làm protein kết tủa,sinh nhiệt và giúp giải phóng chất béo. Ly tâm hỗn hợp bằng cách lắc mạnh hỗn hợp trong 5 phút.
• Bổ sung nước vào chai để đẩy chất béo lên trên cổ chai.Thắt chặt các nút và kết hợp lắc trong 4 phút.
• Đặt chai trong cốc nước 60-63°C trong 5 phút rồi xác định thể tích chất béo bằng vạch đo trên cổ chai.
Hình 6:.Chai badcook
5. Xác định hàm lượng chất béo bằng phương pháp LolchHóa chất: Hóa chất: Metlianol (CHOH); Dung dịch HCl 6N; Dung dịch KCl 0,37M (27,58g//); Cồn tuyệt đối 99". 5.1 Tiến hành
Cân 1 g mẫu phân tích đã nghiền nhỏ (nếu mẫu phán tích là chất rắn) hoặc lấy 2,5- 3ml (nếu mẫu phân tích là chất lỏng) vào cốc của máy li tâm (cốc có nút đậy).
Thêm vào đó 20ml hổn hợp CHCl3/CH3OH với li lệ 2:1 theo thể tích, lắc mạnh trong 1 phút (có thể lắc bằng máy khuấy từ hoặc máy đồng nhất), rồi thêm vào đó 80µl HCl 6N để yên ít nhất 2 giờ, sau đó thêm 4,2ml dung dịch KCl 0,37M, lắc mạnh rồi đưa vào máy li tâm quay khoảng 10 phút, lấy ra dùng pipet loại bỏ phần trên còn phần dưới cho vào đó 10 ml dung dịch H 2O/CH3OH/CHCl3, (dung dịch này pha sẵn theo tỉ lệ 47/48/3 theo thể tích), lắc mạnh rồi ly tâm, loại bỏ phần trên còn phần dưới lại cho 10 ml H2O/CH3OH/CHCl3 rồi lặp lại như trên lần 2.
Sau khi loại bỏ phần trên, phần còn lại cho vào phễu chiết, thêm vào đó một ít CHCl3, và nước cất lắc mạnh để lắng rồi thu hồi lấy phần dưới vào một bình cầu đã
cân sẵn để biết trọng lượng. Lại cho thêm CHCl3, và nước vào phần còn lại ở phếu chiết, lắc để thu hồi hết chất béo còn lại ở phần trên.
Phần dưới lại thu hồi vào bình cầu trên, sau đó lắp bình cầu vào một bộ cất chân không để cất đuổi CHCl3 sau đó cho ít cồn tuyệt đối vào bình cầu và cất cho đốn khơ. Phần cịn lại trong binh cầu chi là chất béo. Để bình cầu vào bình hút ẩm rồi cân (nếu trường hợp thấy trong bình cầu đục hoặc có cặn thì cho vào đó ít CHCl3, và lọc qua lớp bột amiăng, cát, bông thuỷ tinh rồi rnới cất đổ tách hết CHCl3).
5.2 Tính kết quả
Hàm lượng chất béo theo % tính bằng cơng thức sau:
X% = G2−GG 1.100
Trong đó:
G1: trọng lượng bình cầu chứa chất béo (g) G2: trọng lượng bình khơng (g)
G: trọng lượng mẫu phân tích (g)
PHẦN IV: PHÂN TÍCH VITAMIN
Vitamin, cịn gọi là sinh tố, là một yếu tố dinh dưỡng không thể thiếu của mọi sinh vật, đó là những hợp chất hữu cơ có trọng lượng phân tử nhỏ, có cấu tạo hóa học rất khác nhau, nhưng đều có hoạt tính sinh học đảm bảo cho các q trình chuyển hóa trong cơ thể hoạt động bình thường, và có ảnh hưởng đến sự trao đổi chất của sinh vật.
Khi nói đến chất dinh dưỡng thì khơng ai lại khơng nghĩ đến vitamin, nó được coi là một chất dinh dưỡng không thể thiếu trong bữa ăn hằng ngày. Nó có vai trị rất quan trọng đến sự sinh trưởng và phát triển của con người, nếu thiếu Vitamin thì con người sẽ mắc một số bệnh như thiếu vitamin A thường có triệu chứng quáng gà, thiếu vitamin B12 dễ teo não, thiếu vitamin D có liên quan đến bệnh phổi tự miễn, Ngoài ra, chúng ta cần phải quan tâm đến hàm lượng vitamin trong thực phẩm để lựa chọn các thực phẩm sao cho phù hợp với cơ thể để tránh tình trạng thừa vitamin.
Phương pháp xác định một số vitamin:
Vitamin tan trong dầu
1. Caroten: Xác định caroten bằng phương pháp cột.1.1 Nguyên tắc 1.1 Nguyên tắc
Tách caroten ra khỏi lương thực, thực phẩm bằng phương pháp sắc ký cột rồi đem so màu.Đầu tiên cho một lượng nhỏ chất phân tích vào đầu cột, cho tiếp xúc với vật liệu hấp thụ, cho pha động chạy qua cột. do các cấu tử có ái lực khác nhau với pha tĩnh nên chất nào có ái lực mạnh hơn với pha tĩnh thì sẽ bị giữ lại lâu hơn cịn những chất có ái lực yếu hơn sẽ bị pha động cuốn ra khỏi cột với vận tốc khác nhau.Sau đó lấy các cấu tử đã được tách ra đem so sánh với mẫu chuẩn.
Hóa chất:
• Cát tinh chế: đổ cát qua rây có đường kính lỗ 4 - 5mm. Rửa cát qua rây bằng nước máy, rồi dùng HCl( tỷ lệ 1/1) cho vào cát, khuấy kỹ, ngâm 1 đêm. Rủa cát cho tới hết axit. Rủa lại bằng nước cất, sấy khơ.
• Benzen: nhiệt độ sơi 70 – 80 0C. • Chất hấp phụ: nhơm oxit (Al2O3) • Natrisunfat khan (Na2SO4). • Dung dịch azobenzen tiêu chuẩn
1.2 Cách tiến hành.
Cân 5g mẫu lương thực, thực phẩm khô cho vào cối sứ nghiền kỹ với 5g cát sạch trong 30 phút. Để làm khô kỹ, ta cho thêm vào cối sứ 10g Na2SO4 khan nghiền tiếp hỗn hợp trong 30 phút nữa.
Phần dưới của cột sắc ký kỹ với 5g cát sạch trong 30 phút.Để làm khô kỹ, ta cho thêm được nhồi bơng thấm nước.Sau đó cột được nhồi nhơm oxyt khoảng 2/3 cột.Dùng đũa thủy tinh nén nhôm oxyt cho chặt.Trên cùng lại đặt 1 lớp bông dày 1cm.
Bột khô từ cối được chuyển vào phần trên của cột sắc ký.Cho bezen vào cột đến khi thấy lớp bột khơng thấm benzen nữa.Sau đó dùng bơm hút nhẹ để lớp bột được rữa chầm chậm bằng benzen đến khi khơng cịn thấy những giọt màu vàng chảy ra khỏi cột sắc ký vào bình hứng. cần chú ý cho bezen phủ ngập lớp bột vì caroten dễ bị oxy hóa bởi khơng khí.
Chuyển tồn bộ caroten từ bình hứng vào bình định mức dung tích 50ml hoặc 100ml (tùy thể tích nước hứng được) và thêm bezen đến vạch mức, lắc nhẹ. Dung dịch caroten này được đem so màu cùng với dung dịch azobenzen tiêu chuẩn (đã pha loãng 10 lần). Trong 1ml dung dịch có màu giống dung dịch azobenzen tiêu chuẩn chứa 0,00235 mg caroten.
2. Xác định vitamin A bằng phương pháp so màu.2.1 Nguyên tắc 2.1 Nguyên tắc
Vitamin A là một alcohol cao cấp chưa no có cơng thức hóa học như hình sau và thường kết hợp với axit béo (palmitic và stearic) tạo thành este phức tạp. Vì vậy khi muốn