4.1 Kết luận
Chủng nấm Trichoderma TC25 và TC15 sinh trưởng mạnh, chỉ sau 3 ngày nuôi
cấy đã phát triển đầy đĩa petri 8 cm.
Đã tiến hành tách chiết được hợp chất kháng nấm peptaibol có trong hai chủng nấm Trichoderma TC25 và TC15.
Đã tiến hành xác định cấu trúc và thành phần có trong hợp chất peptaibol bằng các phương pháp sắc ký. Trong đó, peptaibol của chủng TC25 có chứa 14 amino acid tương tự các Trichobrachin do loài Trichoderma harzianum sinh tổng hợp. Peptaibol của chủng TC15 thuộc nhóm Trichobrachin có chứa 11 amino acid chủ yếu do loài
Trichoderma parceramosum sinh tổng hợp.
Peptaibol thô thu nhận được từ 2 chủng Trichoderma TC25 và TC15 có khả năng ức chế cao đối với nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng thanh long.
4.2 Kiến nghị
Do thời gian thực hiện có hạn nên đề tài vẫn cịn nhiều hạn chế, sinh viên có một số kiến nghị:
Tiến hành khảo sát khả năng đối kháng của hợp chất Trichobrachin trên nhiều chủng nấm bệnh khác như Colletotrichum, Fusarium,….
Khảo sát hiệu lực ức chế của hợp chất Trichobrachin với nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng trên trái thanh long.
Khảo sát thử nghiệm bảo quản trái thanh long thương phẩm bằng chế phẩm Trichobrachin.
64
TÀI LIỆU THAM KHẢO
• Tài liệu tiếng việt:
1. Nguyễn Hoàng Anh, 2013. Tối ưu hóa điều kiện thu nhận bào tử nấm
Trichoderma sp. nhằm định hướng tạo chế phẩm sinh học trừ nấm bệnh trên cây
trồng, Khóa luận tốt nghiệp chuyên ngành Công nghệ sinh học, Trường Đại học Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh.
2. Phạm Ngọc Dung và cộng sự, 2012. “Nghiên cứu sử dụng nấm đối kháng
Trichoderma asperellum trong phòng trừ nấm Phytophthora spp. gây bệnh trên
cây cao su”. Tạp chí bảo vệ thực vật, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, số 12.
3. Bùi Xuân Đồng, 1982. Vi nấm, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
4. Giáo trình mơ đun (2011) “Thu hoạch và bảo quản thanh long”, Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn.
5. Nguyễn Duy Long và cộng sự, 2017. Sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học chứa Trichobrachin để phịng trừ một số lồi nấm bệnh gây hại trên cây trồng (giai đoạn 1), Báo cáo tóm tắt nhiệm vụ khoa học cơng nghệ cấp cơ sở, Trung tâm ươm tạo doanh nghiệp nông nghiệp cơng nghệ cao.
6. Nguyễn Văn Hịa và cộng sự, 2009. Nghiên cứu giải pháp phòng trừ bệnh thối rễ trên một số cây ăn quả đặc sản (cây có múi, vú sữa, sầu riêng và ổi) ở đồng bằng sông Cửu Long, Hội thảo quốc gia về cây trồng lần thứ nhất.
7. Nguyễn Thành Hiếu và cộng sự, 2014. Nghiên cứu xác định tác nhân, đặc điểm hình thái và sinh học của nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng trên cây Thanh Long (Hylocereus undatus), Hội thảo Quốc gia Bệnh hại thực vật Việt Nam 6-7/4/2014.
8. Phan Thị Thu Hiền và cộng sự, 2014. Nghiên cứu định danh và khảo sát đặc điểm sinh học của tác nhân gây bệnh đốm trắng hại Thanh Long (Hylocereus undatus), Hội thảo Quốc gia Bệnh hại thực vật Việt Nam 6-7/4/2014.
9. Lê Thị Huệ, 2010. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của một số
chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trichoderma và ứng dụng, Luận văn thạc
sĩ sinh học, trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh.
10. Vũ Triệu Mân, 2007. Giáo trình Bệnh cây chuyên khoa, Chuyên ngành Bảo vệ thực vật, Trường Đại học Nông Nghiệp I, Hà Nội. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
11. Lê Thiên Minh (2012), “Nghiên cứu ứng dụng một số chế phẩm sinh học nhằm nâng cao chất lượng và kéo dài thời gian bảo quản thanh long”.
12. Sở nơng nghiệp và phát triển nơng thơn Bình Thuận, Trung tâm NCPT cây thanh long, 2008, Quy trình sản xuất thanh long theo Viet GRAP.
65
13. Le Van To, Nguyen Ngu, Nguyen D. Duc, Dang T.K. Trinh, Nguyen C. Thanh, Dang V.H. Mien, Chau N. Hai and Trinh N. Long. “Quality assurance system for
dragon fruit”, (2000).
14. Trần Thị Thanh Thuần, 2009. Nghiên cứu xử lý vỏ cà phê bằng Trichoderma
viride và Aspergillus niger để sản xuất phân bón hữu cơ bán tổng hợp, Khóa luận
tốt nghiệp chuyên ngành Công nghệ sinh học, Trường Đại học Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh.
15. Trần Thị Thuần, 1996. Kết quả nghiên cứu bước đầu về nấm đối kháng
Trichoderma, Tuyển tập cơng trình nghiên cứu bảo vệ thực vật 1990 – 1995, Nxb.
Hà Nội.
• Tài liệu tiếng anh:
1. Agrios G.N, 2005. Plant pathology, 5th edition, Elsevier Academic Press: San Diego, California.
2. Baek Jong-Min, C. R. Howell, Charles M. Kenerley (1998), “The role of an extracellular chitinase from Trichoderma virens Gv29-8 in the biocontrol of
Rhizoctonia solani”, Curr Genet, Vol. 35, pp. 41-50.
3. Brukner H, Reinecke C, Kripp T. 1993. 4th International Congress of Plant Pathology, pp. 2918-2921.
4. Chen K, Yang HT, Li JS. 2007. Analysis of chemical components and antifungal activity of extraction from conidia of Trichoderma viride Ltr-2. J. Microbiol. 34: 455-458.
5. Degenkolb et al., 2008. Unraveling the efficient applications of secondary metabolites of various Trichoderma spp.
6. Dennis C, Webster J. 1971. Antagonistic properties of species-groups of Trichoderma: iii. hyphal interaction. Trans. Br. Mycol. Soc. 57: 363-369. 7. D. Ezra, O. Liarzi, T. Gat, and M. Hershcovich (2013), First Report of Internal
Black Rot Caused by Neoscytalidium dimidiatum on Hylocereus undatus (Pitahaya) Fruit in Israel, Volume 97, Number 11.
8. Druzhinina S. I. et al. (2006), “The first 100 Trichoderma species characterized by monecular data”, Mycoscience, 47, pp. 55-64.
9. Dunlap CA, Bowman MJ, Schisler DA. Genomic analysis and secondary metabolite production in Bacillus amyloliquefaciens AS 43.3: a biocontrol antagonist of Fusarium head blight. Biol Control. 2013;64(2):166–175.
10. Edson et al, 2007. Peptaibols of Trichoderma, The Royal Society of Chemistry 2007.
66
11. Francesco Vinale, 2008. Trichoderma–plant–pathogen interactions,Soil Biology & Biochemistry: p. 1-10.
12. Fokkema, N.J., 1976. Antagonism Between Fungal Saprophytes and Pathogens on Aerial Plant Surfaces. In: Microbiological of Aerial Plant Surfaces, Dickinson C.H. and T.F. Preece (Eds.). Academic Press, London, pp: 486-506.
13. Gary E. Harman, C. P. Kubicek, 2005. Trichoderma And Gliocladium:
Enzymes, Biological Control and commercial applications, Volume 2, This
edition published in the Taylor & Francis e-Library.
14. Gary J. Samuels, 2004. Trichoderma aguide to identification and biology, United States Department of Agriculture Research Service Systematic Botany and Mycology Laboratory 304, B-011A Beltsville, MD 20705-2350, USA. 15. Howell C. R. (2002), “Mechanisms employed by Trichoderma spp. in the (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
biological control of plant diseases: the history and evolution of current concepts”, Plant Diseases, 87(1), pp. 4-10.
16. Jamil Shafi, Hui Tian & Mingshan Ji, 2017.Bacillus Species as versatile weapons for plant pathogens: a review. Journal of Biotechnology & Biotechnological Equipment Volume 31.
17. Juliana F. de S. Daniel* and Edson Rodrigues Filho, 2007. Peptaibols of Trichoderma.
18. Kamala T. and S. Indira, 2011. Evaluation of indigenous Trichoderma isolates
from Manipur as biocontrol agent against Pythium aphanidermatum on common beans. 3 Biotech, 1(4): p. 217-225.
19. Kandasamy Saravanakumar, 2017. Effect of Trichoderma harzianum on maize rhizosphere microbiome and biocontrol of Fusarium Stalk rot.
20. Lau, C.Y, Othman, F., and Eng, L., “The effect of heat treatment, different packaging methods storage temperatures on shelf life of Dragon fruits (Hylocereus spp.)”, P1-16.
21. Li GH, Yang ZS, Zhao PJ, Zheng X, Luo SL, Sun R, et al. 2011. Three new acorane sesquiterpenes from Trichoderma sp. Ymf1.02647. Phytochem. Lett. 4: 86-88.
22. Nerd, A., GUT MAN, F&MiZRAHI, Y., (1999), “Ripenting and postharvers behaviour of fruits of two hylocereus species (Cactaceae)”, Postharvest Biology
and Technology 17, pp. 39-45.
23. Parisa rahimi Tamandegani, Dous Tmorad Zafari, Tamas Marik, (2016)
“Peptaibol profiles of Iranian Trichoderma isolates”, Acta Biologica Hungarica 67, pp. 431–441.
67
24. Prasun K. and R. Kanthadai (1997), “Effect of temperature an ortagonistic and biocontrol potential of Trichoderma spp. on Scerotium rolfsii”, Mycopathology, 139, pp. 151-155.
25. Radhakrishnan R, Hashem A, Abd Allah E., 2017. Bacillus: A Biological Tool for Crop Improvement through Bio-Molecular Changes in Adverse
Environments. Front Physiol., 8: 667.
26. Raimo Mikkola, Maria A. Andersson, László Kredics, Pavel A. Grigoriev, Nina Sundell, Mirja S. Salkinoja-Salonen, 2012., 20-Residue and 11-residue peptaibols from the fungus Trichoderma longibrachiatum are synergistic in forming
Na+/K+-permeable channels and adverse action towards mammalian cells. 27. Roiger D. J, Jeffers S. N., Caldwell R. W. (1991), “Occurrence of Trichoderma
species in apple orchard and wooland soil”, Soil. Biol. Biochems, 23, pp. 353-359. 28. Ruiz N , Wielgosz-Collin G , Poirier L , Grovel O , Petit KE , Mohamed,
Benkada M , du Pont TR , Bissett J , Vérité P , Barnathan G , Pouchus YF., 2007. New Trichobrachins, 11-residue peptaibols from a marine strain of Trichoderma longibrachiatum.
29. Samuels G. J. (2000), “Trichoderma systematic, the sexual state and ecology”,
Phytopathology, 96, pp. 195-206.
30. Stoppacher N, Kluger B, Zeilinger S, Krska R, Schuhmacher R. 2010. Identification and profiling of volatile metabolites of the biocontrol fungus Trichoderma atroviride by Hs-SpmeGc-Ms. J. Microbiol. Methods 81: 187-193. 31. Sun CY, Pan J, Chen XL. 2002. Screen of biocontrol Trichoderma spp
inhibiting Pseudomonas solanacearum 3 of ginger and its mechanism. J. Shandong Univ. 37: 373-376.
32. Susanne Zeilinger and Markus Omann, 2007. Trichoderma Biocontrol: Signal. 33. Raimo Mikkola, Maria A. Andersson, László Kredics, Pavel A. Grigoriev, Nina
Sundell, Mirja S. Salkinoja-Salonen, 2012., 20-Residue and 11-residue peptaibols from the fungus Trichoderma longibrachiatum are synergistic in forming
Na+/K+-permeable channels and adverse action towards mammalian cells.
34. Vinale F, Manganiello G, Nigro M, Mazzei P, Piccolo A, Pascale A, Ruocco M, Marra R, Lombardi N, Lanzuise S, Varlese R, Cavallo P, Lorito M, Woo SL., 2014. A Novel Fungal Metabolite with Beneficial Properties for Agricultural Applications. 2014 Jul; 19(7): 9760–9772
35. Vinit Kumar Mishra, 2010. In vitro antagonism of Trichjoderma species against
68 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
36. Weindling R. (1932), “Trichoderma lignorum as a parasite of other fungi”,
Phytopathology, 22, pp. 837-845.
37. Zoltan Nasztora, J.nos Horv.tha, Bal.zs Leitgeb (2015), Studying the Structural and Folding Features of Long-Sequence Trichobrachin Peptides, Chemistry & Biodiversity, Vol. 12, pp.1365-1378.
• Tài liệu tham khảo internet:
1. Nấm gây bệnh đốm trắng trên cây thanh long, ngày xem 14/7/2019
<https://123doc.org//document/2566881-nghien-cuu-xac-dinh-nam-gay-benh-loet- tren-cay-thanh-long.htm>
2. Tình hình bệnh dốm trắng trên cây thanh long, ngày xem 13/7/2019
<http://ppri.org.vn/tinh-hinh-benh-dom-trang-thanh-long-va-phuong-an-giai-quyet-
c2a114.html>
3. Tổng quát về peptaibol, ngày xem 14/7/2019 <https://en.wikipedia.org/wiki/Peptaibol>
1
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC A: Tỷ lệ đối kháng nấm Neoscytalidium dimidiatum
The ANOVA Procedure
Dependent Variable: N
t Tests (LSD) for N
Source DF
Sum of
Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 3 47.41932014 15.80644005 13.45 0.0017
Error 8 9.40147854 1.17518482
Corrected Total 11 56.82079868
R-Square Coeff Var Root MSE N Mean
0.834542 1.690082 1.084059 64.14242
Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F
T 3 47.41932014 15.80644005 13.45 0.0017
Alpha 0.01
Error Degrees of Freedom 8
Error Mean Square 1.175185 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Critical Value of t 3.35539
2 2X 4X 6X 8X 67.0605 64.6712 63.1508 61.6872 T Estimate
N t Grouping for M eans of T (Alpha = 0.01)
3
PHỤ LỤC B: Khả năng sinh trưởng của nấm Trichoderma TC25 và TC15
1. Khả năng sinh trưởng của nấm Trichoderma TC25 và TC15 sau 1 ngày
The TTEST Procedure Variable: D
N Mean Std Dev Std Err Minimum Maximum
10 2.3500 1.6675 0.5273 -1.5000 4.5000
With 95% Confidence Interval for Mean
Distribution of D 95% Confidence 0 20 40 60 80 Pe rc en t 0 20 40 60 80 Pe rc en t Kernel Normal -2 0 2 4 6 D
Mean 95% CL Mean Std Dev 95% CL Std Dev
2.3500 1.1571 3.5429 1.6675 1.1470 3.0442
DF t Value Pr > |t|
4
2. Khả năng sinh trưởng của nấm Trichoderma TC25 và TC15 sau 2 ngày
The TTEST Procedure Variable: D
N Mean Std Dev Std Err Minimum Maximum
10 4.3500 4.9556 1.5671 -3.5000 10.5000 -1 0 1 Quantile -2 0 2 4 D Q-Q Plot of D
Mean 95% CL Mean Std Dev 95% CL Std Dev
4.3500 0.8050 7.8950 4.9556 3.4087 9.0471
DF t Value Pr > |t|
5
With 95% Confidence Interval for Mean
Distribution of D 95% Confidence 0 10 20 30 Pe rc en t 0 10 20 30 Pe rc en t Kernel Normal -10 0 10 20 D
6 -1 0 1 Quantile -5 0 5 10 D Q-Q Plot of D
7
PHỤ LỤC C: Phổ HPLC – UV của alamethicin và các chủng nấm khảo sát tại bước sóng 215nm
1. Phổ HPLC – UV của alamethicin tại bước sóng 215nm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 1. Phổ HPLC – UV của alamethicin tại bước sóng 215nm
2. Phổ HPLC – UV của Trichoderma TC25 tại bước sóng 215nm
8
Hình 2. Phổ HPLC – UV của Trichoderma TC25 tại bước sóng 215nm 3. Phổ HPLC – UV của Trichoderma TC15 tại bước sóng 215nm
Hình 3. Phổ HPLC – UV của Trichoderma TC15 tại bước sóng 215nm
9
PHỤ LỤC D: Cơ sở dữ liệu các amino acid của peptaibol trích xuất từ CPD (Comprehensive Peptaibiotics Database)
ID Abbreviation Residue_free C H N O S MW
MW_
monoisotopic Position Category
1 Aoh
L-(9S)-2- amino-9- hydroxy-8-oxo-
decanoic acid 10 19 1 4 0 217 217,1314074 cyclo
lipoamino acid 2 APAE 2-(2´- aminopropyl)a minoethanol 5 14 2 1 0 118 118,110613 C- terminal amino alcohol 3 b-Ala beta-alanine, 3- amino-
propionic acid 3 7 1 2 0 89 89,047678 internal amino acid
4 BOC ------- Di-tert-butyl dicarbonate ---- -- 10 18 0 5 0 218 218,115423 N- terminal other residue
5 BTA butanoic acid 4 8 0 2 0 88 88,052429
N-
terminal fatty acid
6 DAMP 1,2-diamino-4- methylpentane 6 16 2 0 0 116 116,131348 C- terminal other residue
7 Dec decanoic acid 10 20 0 2 0 172 172,146329
N-
terminal fatty acid
8 desmethyl- AHMOD (2S, 6S)-2- amino-6- hydroxy-8- oxodecanoic acid 10 19 1 4 0 217 217,131407 internal lipoamino acid
10 9 DPD N1,N1- dimethyl- propane-1,2- diamine 5 14 2 0 0 102 102,115698 C- terminal amine 10 DPD-NO (2S)-N1,N1- dimethyl- propane-1,2- diamine-N- oxide 5 14 2 1 0 118 118,1106126 C- terminal amine
11 EtNva ethyl-norvaline 7 15 1 2 0 145 145,110278 internal amino acid
12 HMDA
3-hydroxy 2- methyl-
decanoic acid 11 22 0 3 0 202 202,156894
N- (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
terminal fatty acid
13 HKP hydroxyketone piperazine ring 9 16 2 2 0 184 184,121177 C- terminal other residue 14 Hyleu b-
hydroxyleucine 6 13 1 3 0 147 147,089543 internal amino acid
15 Hyp hydroxyproline 5 9 1 3 0 131 131,0582428 internal amino acid
16 Iva isovaline 5 11 1 2 0 117 117,078978 internal amino acid
17 LAU lauric acid 12 24 0 2 0 200 200,177629
N-
terminal fatty acid
18 Lxx
leucine or
isoleucine
(isobaric) 6 13 1 2 0 131 131,094628 internal amino acid
19 MDA
(2R)-methyl-
decanoic acid 11 22 0 2 0 186 186,161979
N-
terminal fatty acid
20 MeLeu
N-methyl-
leucine 7 15 1 2 0 145 145,110278 internal amino acid
21 MePhe
N-methyl-
11
22 MePro methyl-proline 6 12 1 2 0 130 130,086803 internal amino acid
23 MeVal -----
N-methyl- valine -----------
-------------- 6 11 1 1 0 113 113,0840636 internal amino acid
24 MHA
(4S,2E)-4- methylhex-2-
enoic acid 7 12 0 2 0 128 128,083729 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
N-
terminal fatty acid
25 MOO 2-methyl-N-1- oxooctanoic acid; 1-2- methyl-1- oxooctanoic acid 9 18 0 2 0 158 158,130679 N-
terminal fatty acid
26 MOTDA 2-methyl 3-oxo tetradecanoic acid; 1-2- methyl-1,3- dioxotetradecan oic acid 15 28 0 3 0 256 256,203844 N-
terminal fatty acid
27 MPD N1-methyl- propane-1,2- diamine 4 12 2 0 0 88 88,100048 C- terminal amine 28 MYR myristic acid, tetradecanoic acid 14 28 0 2 0 228 228,208929 N-
terminal fatty acid
29 Oc octanoic acid 8 16 0 2 0 144 144,115029
N-
terminal fatty acid
30 ODec
N-1-oxo-4-
decenoic acid 10 18 0 2 0 170 170,130679
N-
terminal fatty acid
31 PDA
propyl-1,3-
diamine 3 10 2 0 0 74 74,084398
C-
12 32 Phaol 2-(2-amino-3- phenylpropyla mino)ethanol 11 18 2 2 0 210 210,136827 N- terminal amino alcohol 33 PIHPPE 2,3,4,6,7,8- hexahydro-1- pyrrole[1,2- a]pyrimidine 13 26 3 0 0 224 224,212672 C- terminal other residue
34 Pip pipecolic acid 6 11 1 2 0 129 129,078978 internal amino acid
35 Pyr
pyroglutamic
acid 5 7 1 3 0 129 129,042593
N-
terminal amino acid
36 SBA sec-butyl-amine 4 11 1 0 0 73 73,089149 C- terminal amine 37 Vxx valine or isovaline
(isobaric) 5 11 1 2 0 117 117,078978 internal amino acid
38 3M-Pro (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(2S,3S)-3- methylproline,
(cis-l-3-MePro) 6 12 1 2 0 130 130,086803 internal amino acid
39 4MPro 4-methylproline 6 12 1 2 0 130 130,086803 internal amino acid