2.2.4.1. Phương pháp định lượng S100B huyết thanh:
•Nguyên lý xét nghiệm: Định lượng nồng độ S100B huyết thanh bằng phương pháp miễn dịch sandwich dựa trên công nghệ điện hóa phát quang của Roche Diagnostic.
Phương pháp định lượng:
•S100B được định lượng bằng phương pháp miễn dịch sandwich sử dụng công nghệ điện hóa phát quang – ECL (Electro Chemiluminescence). Phương pháp miễn dịch Sandwich được thực hiện như sau: Chất cần định lượng (kháng nguyên) được kẹp giữa hai kháng thể đơn dòng. Kháng thể thứ nhất được gắn với hạt từ là chất giá (Magnetic Microparticle), ở những phương pháp sandwich cổ điển thì không có chất giá mà thành ống nghiệm dùng để thực hiện phản ứng đóng vai trò chất giá, kháng thể thứ hai được gắn với chất đánh dấu có khả năng phát tín hiệu. Khi trong máu bệnh nhân xuất hiện kháng nguyên nó sẽ bị kháng thể bắt lấy nhờ phản ứng kháng nguyên – kháng thể. Phức hợp kháng nguyên kháng thể này được phát hiện bởi chất đánh dấu. Chất đánh dấu là chất có khả năng phát tín hiệu, tín hiệu phát ra là
gì thì tùy thuộc vào bản chất chất đánh dấu và phương pháp phát hiện tín hiệu của chất đánh dấu. Nó có thể phát ra tia phóng xạ nếu là phương pháp miễn dịch phóng xạ, phát ra ánh sáng huỳnh quang nếu là xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang, trường hợp sử dụng công nghệ ECL thì chất đánh dấu phát ra tín hiệu là photon ánh sáng.
• Cụ thể các bước định lượng S100B như sau:
+ Mẫu phân tích có chứa S100B sẽ kết hợp với kháng thể S100B biotin hóa và kháng thể S100B gắn ruthenium trong cốc phản ứng. Thời gian ủ trong 9 phút để kháng thể bắt giữ S100B trong mẫu phân tích.
+ Trong bước tiếp theo các vi hạt từ phủ streptavidin được cho vào cốc phản ứng, tiếp tục ủ trong 9 phút, kháng thể biotin hóa sẽ gắn vào các vi hạt phủ streptavidin.
+ Sau khi ủ 2 lần (18 phút), phức hợp miễn dịch được chuyển tới buồng đo. Phức hợp này sẽ được gắn lên điện cực đang làm việc, còn thuốc thử và mẫu không gắn kết sẽ bị thải ra ngoài bởi dung dịch ProCell.
+ Trong phản ứng ECL, chất liên kết là dẫn xuất ruthenium. Phản ứng tạo ra ánh sáng. Cường độ ánh sáng tỷ lệ thuận với nồng độ S100B có trong mẫu thử.
Công nghệ ECL là kỹ thuật hiện đại sử dụng chất đánh dấu là Ruthenium(II)-tris(bipyrrydyl) [Ru(bys)32+] và Tripopylamine (TPA). Khi phức hợp kháng nguyên – kháng thể có gắn chất đánh dấu được gắn lên bề mặt điện cực thì quá trình khởi động điện bắt đầu. Dưới tác dụng của dòng điện điện áp 2V, hợp chất phát ra photon ánh sáng và giải phóng electron quay trở lại bám trên bề mặt điện cực (Điều này là cơ sở để giải thích tại sao khi vận hành máy phân tích cứ mỗi 2 tuần lại phải rửa điện cực bằng dung dịch rửa và qui trình dành riêng. Việc làm này nhằm loại bỏ các electron bám
trên bề mặt điện cực làm cản trở hoạt động của điện cực). Cường độ ánh sáng tỷ lệ với nồng độ chất cần phân tích và là cơ sở cho việc tính toán nồng độ chất này. ECL đã khắc phục nhược điểm của hóa phát quang (Chemiluminescence) nên có độ nhạy và đặc hiệu cao hơn hóa phát quang do vậy kết quả xét nghiệm sử dụng công nghệ ECL có độ chính xác cao và tin cậy. Công nghệ này được phát triển ở nhiều hệ thống máy phân tích của hãng Roche như Elecsys 2010, Cobas e411, Cobas 6000 – Modul e601, Modular Analytics – Modul E170…là những hệ thống máy phân tích có ở Khoa Hóa sinh Bệnh viện Bạch mai dùng để định lượng S100B và các thông số hóa sinh khác khi tiến hành nghiên cứu.
Đặc tính kỹ thuật khi phân tích S100B trên hệ thống máy miễn dịch tự động của Roche như sau:
S100B
Công nghệ Điện hóa phát quang-ECL
Thời gian 18 phút Nguyên lý Sandwich Thể tích mẫu 20 µl Độ ổn định của S100B trong mẫu bệnh phẩm Từ 15 - 25 oC: 8 giờ 2 – 8oC: 2 ngày - 20 oC: 3 tháng (Chỉ tan đông 1 lần) Khoảng đo 0,005 – 39 ng/ml
Loại mẫu Huyết thanh
Độ chính xác E2010/e411:CV 1.3 – 2.1 % E170/e601 CV 0.7 – 1.8 % • Thu thập và bảo quản mẫu:
- Mẫu thu thập là huyết thanh không vỡ hồng cầu, Bilirubin < 428 micromoL/L (<25mg/dL), Lipid < 1500 mg/dL.
- Mẫu được bảo quản ở – 200 C (bền trong 3 tháng).
2.2.4.2. Phương pháp định lượng một số xét nghiệm hóa sinh máu
Xét nghiệm Phương pháp định lượng Glucose (mmol/L) Phương pháp động học enzym
Ure (mmol/L) Phương pháp động học enzym
Creatinin (µmol/L) Phương pháp động học enzym
Bil T (µmol/L) Phương pháp enzym so màu
Bil D (µmol/L) Phương pháp enzym so màu
Albumin ( g/L) Phương pháp so màu
Protein (g/L) Phương pháp so màu
AST (U/L) Phương pháp động học enzym
ALT (U/L) Phương pháp động học enzym
GGT (U/L) Phương pháp động học enzym
- Các xét nghiệm thực hiện trên máy phân tích hóa sinh tự động tại khoa Hóa sinh, bệnh viện Bạch Mai gồm Cobas 8000 modul c702, Cobas 6000 modul c501, Modular modul P800 và thuốc thử, chất chuẩn của Roche Dianogstic, kiểm tra chất lượng của Bio-Rad.