4.4. Thí nghiệm 4: Áp dụng quy trình ly trích lên các vị trí khác nhau của lơng
Thí nghiệm đƣợc bố trí trên các lơ mẫu gốc lơng, thân lơng, ngọn lông và cả sợi lông heo. Kết quả đo OD và hàm lƣợng DNA đƣợc trình bày trong bảng 4.4a.
Bảng 4.4a. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các vị trí của lơng heo
Chỉ tiêu Mẫu p Gốc Thân Ngọn Cả sợi Tỷ số OD 2,05±0,15 a 1,84±0,15 b 1,40±0,15 c 1,75±0,15 b 0,04 Hàm lƣợng DNA (µg/µl) 0,33±0,15 a 0,30±0,15 ab 0,24±0,15 c 0,28±0,15 b 0,03 Số mẫu 10 10 10 10 2,05 1,84 1,4 1,75 0,33 0,3 0,24 0,28 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Gốc Thân Ngọn Sợi Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg/µl)
Biểu đồ 4.4. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các vị trí lơng heo
586 bp
1: Mẫu gốc lông không sử dụng CTAB 2: Mẫu gốc lông sử dụng CTAB 0,1% 3: Mẫu gốc lông sử dụng CTAB 0,2% 4: Mẫu ĐC (DNA ly trích từ cơ)
30
Qua bảng 4.4a cho thấy có sự khác biệt về tỷ số OD trên các vị trí khác nhau của lơng heo (P < 0,05). Vị trí cho tỷ số OD tốt nhất là mẫu gốc lông (2,05), tiếp theo là mẫu thân lơng (1,84), vị trí cho tỷ số OD thấp nhất là mẫu ngọn lơng (1,40), vị trí cho tỷ số OD chấp nhận đƣợc là cả sợi lơng (1,75). Ngun nhân có thể là do mức độ keratin hóa ở gốc ít hơn ở ngọn cho nên việc tách keratin ra khỏi hỗn hợp DNA ly trích từ gốc dễ dàng hơn so với phần ngọn.
Kết quả cho thấy hàm lƣợng DNA thu hồi từ mẫu gốc lông đạt cao nhất (0,33 µg/µl). Trong khi đó, mẫu thân lông đạt 0,3 µg/µl, mẫu cả sợi lông đạt 0,28 µg/µl và mẫu ngọn lơng là thấp nhất (0,26 µg/µl). Sự khác biệt này rất có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,05). Nguyên nhân có thể là do phần lớn tế bào ở ngọn lơng là tế bào chết nên mất hết DNA, vì thế lƣợng DNA thu hồi sẽ ít hơn so với lƣợng DNA thu hồi từ gốc và thân lông (nơi có nhiều tế bào cịn sống).
Bảng 4.4b. Kết quả PCR từ các vị trí lơng heo Mẫu Số mẫu tiến hành
PCR Số mẫu có sản phẩm PCR Tỷ lệ mẫu có sản phẩm PCR (%) P Gốc lông 10 7 70 0,03 Thân lông 10 6 60 Ngọn lông 10 0 0 Sợi lông 10 5 50
Qua bảng 4.4b cho thấy DNA ly trích từ mẫu gốc lông cho tỷ lệ thành công của phản ứng PCR cao nhất (70%), tiếp theo là mẫu thân lông (60%) và mẫu cả sợi lông (50%). Mẫu ngọn lông do tỷ số OD còn quá thấp nên phản ứng PCR không xảy ra (tỷ lệ PCR thành công là 0%). Sự khác biệt này là có ý nghĩa (p < 0,05). Trong các nghiên cứu sử dụng mẫu lông của thú sống, việc nhổ cả sợi lơng trên mình thú với số lƣợng lớn sẽ dễ làm cho thú bị stress, ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng, phát triển và sinh sản của thú. Để giải quyết vấn đề này, chúng ta có thể dùng dao cắt những sợi lông ngay trên bề mặt da thú rồi áp dụng quy trình ly trích DNA cho mẫu thân lơng.
Nhƣ vậy, ly trích DNA từ gốc lơng và thân lơng sẽ cho DNA chất lƣợng tốt hơn so với cả sợi lông và ngọn lông. Trong trƣờng hợp thú sống, sử dụng mẫu thân lơng để ly trích DNA thì thích hợp hơn cả. Do vậy, có thể xem thân lơng là vị trí thích hợp để ly trích DNA.
1 2 3 4 5 6 7 8
Hình 4.4a. Kết quả PCR vị trí gốc lông
1 2 3 4 5 6 7 8
Hình 4.4b. Kết quả PCR vị trí thân lơng
586 bp
586 bp
1->7: Các mẫu gốc lông
8: Mẫu ĐC (DNA đƣợc ly trích từ cơ)
1->7: Các mẫu thân lông
32
1 2 3 4 5 6 7 8
Hình 4.4c. Kết quả PCR vị trí cả sợi lơng
586 bp
1->7: Mẫu sợi lông
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận 5.1. Kết luận
- Sử dụng buffer ly trích chứa proteinase K ởcác nồng độ 0,8 mg/ml, 1 mg/ml và 1,2 mg/ml đều cho chất lƣợng DNA tốt với tỷ số OD từ 1,75 – 1,84.
- DNA đƣợc ly trích với DTT ở nồng độ 50 mM khá tinh sạch (OD = 1,65) và thành công khi đƣợc dùng làm nguồn mẫu cho phản ứng PCR.
- Sử dụng CTAB 0,2% cho DNA tinh sạch (tỷ số OD trung bình là 1,80) và phản ứng PCR khuếch đại đƣợc gen halothan ở nồng độ này.
- Vị trí gốc lơng cho DNA ly trích tinh sạch nhất (OD = 2,05), tiếp theo là vị trí thân lơng (OD = 1,84), cả sợi lơng (OD = 1,75),vị trí ngọn lông (OD = 1,4). Phản ứng PCR khuếch đại gen halothane cho tỷ lệ thành công cao nhất đối với mẫu gốc lông (70%), tiếp theo là mẫu thân lông (60%) và cả sợi lông (50%). Phản ứng PCR không thành công đối với mẫu ngọn lông.
5.2. Đề nghị
- Tiếp tục cải thiện quy trình ly trích DNA từ lơng để cho hiệu suất PCR cao nhất.
- Sử dụng thân lông (đoạn 1 cm kể từ da thú trở lên) dùng làm nguyên liệu ly trích DNA.
- Áp dụng quy trình ly trích DNA từ lơng này lên các lồi thú khác nhau, kể cả với lông ngƣời trong những lĩnh vực có liên quan.
34
PHẦN VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO *Tài liệu Tiếng Việt *Tài liệu Tiếng Việt
1. Bùi Thị Ngọc Bích, 2006. Sử dụng một số hóa chất để cải thiện hiệu quả ly trích
DNA từ lơng. Khóa luận tốt nghiệp, ngành Công Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại
học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam.
2. Đinh Văn Chỉnh và ctv, 1999. Xác định tần số kiểu gen và tính năng sản xuất của lợn Landrrace và Yorshire có các kiểu gen khác nhau đƣợc ni ở một số cơ sở giống miền Bắc. Báo cáo Khoa học – NXB Nông Nghiệp.
3. Lê Thị Thu Hà, 2006. Chọn lọc đàn giống hạt nhân qua đánh giá giá trị giống kết
hợp với phân tích gen estrogen (Esr), halothane (Hal). Đề tài nghiên cứu
khoa học và phát triển công nghệ, Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông nghiệp miền Nam, Việt Nam.
4. Lê Thị Thu Phƣơng, 2004. Phát hiện gen halothane, gen thụ thể estrogen và mối
liên quan giữa hai gen này đến năng suất sinh sản của heo nái. Luận văn thạc
sỹ khoa học nông nghiệp, Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam.
5. Lƣơng Quý Phƣơng, 2006. Sản xuất bộ kit ly trích DNA và kit phát hiện gen halothane trên heo. Khóa luận tốt nghiệp, ngành Công Nghệ Sinh Học,
Trƣờng Đại học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam.
6. Nguyễn Ngọc Tuân, Trần Thị Dân, 2000. Vài kinh nghiệm ứng dụng PCR để phát hiện gen halothane và gen thụ thể estrogen , mối quan hệ giữa hai gen này với sức sản xuất của nái, nọc và heo thịt. Hội nghị KH chuyên ngành Chăn nuôi -Thú y.
7. Nguyễn Ngọc Tuân và Trần Thị Dân, 2005. Ảnh hƣởng của gen halothane, gen thụ thể estrogen đến năng suất sinh sản và phẩm chất thịt. Tạp chí KHKT Nông Lâm Nghiệp, số 2&3/2005.
8. Nguyễn Văn Út, 2005. Xác định giới tính bằng kỹ thuật multiplex PCR trên 3 giống bị. Khóa luận tốt nghiệp,ngành Cơng Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại học
*Tài liệu Tiếng Anh
9. DeSilva U., Guo X., Kupfer D.M., Fernando S.C., Pillai A.T.V., F. Z., Najar S. So, Fitcha G.Q., Roeb B.A., 2003. Allelic variants of ovine prion protein gene (PRNP) in Oklahoma sheep. Cytogenet Genome Res 102: 89 – 94.
10. Elizabeth A. G, David R. F., 2005. A simplified method for mitochondrial DNA extraction from head hair shafts. J. Forensic Sci 50: 5.
11. Galan M., Baltzinger C., Hewison A. J. M., Cosson J., 2003. Deer species identification using DNA extracted from hair samples and the polymerase chain reaction (PCR) method. Trends in Ecology and Evolution 12: 223 – 227.
12. Haase A., Retzel E. F., Stakus K. A., 1990. Amplification arid detection of lentiviral DNA inside cells. Proc. Natl Acad. SCUSA 87: 4971 – 4975.
13. Pfeiffer, I. Volkel, H. Taubert, B. Brenig, 2004. Forensic DNA-typing of dog hair: DNA-extraction and PCR amplification. Forensic Science International
141: 149 – 151.
14. James N. J., Mary V. A., 2004. Genetic variability and population differentiation in Captive Baird’s Tapirs (Tapirus bairdii). Zoo Biology 23: 521– 531.
15. Mark R. Wilson, Joseph A. DiZinno, Deborah Polanskey, Jeri Replogle, Bruce Budowle, 1995. Validation of mitochondrial DNA sequencing for forensic casework analysis. J. Legal Med 108: 68 – 74.
16. Mark R. Wilson, Joseph A. DiZinno, Deborah Polanskey, Jeri Replogle, Bruce Budowle, 1995. Validation of mitochondrial DNA sequencing for forensic casework analysis. J Legal Med 108: 68 – 74.
17. McNevin D., Wilson - Wilde L., Robertson J., Kyd J., Lennard C., 2005. Short tandem repeat (STD) genotyping of keratinised hair. Forensic Science International 153: 237 – 259.
18. Morel G., Berger M., Ronsin B., Recher S., Richard- Blum S., Mertani H.C., Lobie P. E., 1998. In situ reverse transcription - polymerase chain reaction. Applications for light and electron microscopy. Biology of the Cell 90: 137 – 154. 19. Nozawa H.D., Yanamoto T., Uchihi R., Yoshimoto T., Tamoaki K., Hayash S.,
Ozawa T., KatsumataY., 1999. Purification of nuclear DNA from single hair shafts for DNA analysis in forensic sciences. Legal Med 1: 61 – 67.
36
20. Rees J. L., 2003. Genetics of hair and skin colour. Annu. Rev. Genet 37: 67 – 90. 21. Riginaldo Gaspar Bastos, Joreci Federizzi, Joao Carlos Deschamps, Ricardo
Cardellino and Odir Antonio Dellagostin, 2000. Characterization of swine stress gene by DNA testing using plucked hair as a source of DNA. Genetics
and Molecular Biology 23: 815 – 817.
22. Sake R. K., Scharf S., Faloona F., Mullis K. B., Horn Mullis K.B., Horn G., Erlich H.A., Amheim N., 1985. Enzymatic amplification of globin genomic sequences and restriction site.analysis for diagnosis of sickle cell anemia.
Science 230: 1350 – 1355.
23. Sauer S., Lechner D., Berlin K., Plancon C., Heuermann A., Lehrach H., and Gut G. I., 2000. Ful flexibility genotyping of single nucleotide polymorphisms by the good assay. Nucleic Acids Research 28: p. 23.
24. Vigilant L., 1999. An evaluation of techniques for the extraction and amplification of DNA from naturally shed hairs. Bio. Chem 390: 1329 – 1321.
25. Werner A. Baumgartner, 1979. Radioimmunoassay of hair for determining opiate abuse histories, J. Nucl Med 20: 749 – 752.