PHẦN I MỞ ĐẦU
PHẦN III NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4. Phƣơng pháp tiến hành
3.4.2.1. Thiết lập quy trình ly trích DNA từ lơng heo
Để thiết lập quy trình ly trích DNA từ lơng heo ổn định và hiệu quả, một số yếu tố đã đƣợc khảo sát để tìm ra quy trình tối ƣu.
* Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ proteinase K
Proteinase K có tác dụng phân hủy keratin (một thành phần protein chính của lơng) và bảo vệ những acid nucleic bằng cách phá hủy enzyme ribonuclease (McNevin và cs, 2005). Thí nghiệm 1 đƣợc bố trí nhằm khảo sát khả năng phân cắt keratin của proteinase K ở các nồng độ khác nhau. Thí nghiệm đƣợc bố trí để so sánh 3 quy trình ly trích: quy trình 1 sử dụng proteinase K nồng độ 0,8 mg/ml; quy trình 2 sử dụng proteinase K nồng độ 1 mg/ml và quy trình 3 sử dụng proteinase K nồng độ 1,2 mg/ml (các yếu tố khác đƣợc giữ nguyên nhƣ trong quy trình tham khảo). Các bƣớc tiến hành theo quy trình tham khảo. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên một yếu tố. Mẫu thí nghiệm là mẫu gốc lông heo. Số mẫu đƣợc khảo sát là 4 cho mỗi nghiệm thức. Chỉ tiêu khảo sát là tỷ số OD, hàm lƣợng DNA thu hồi, sản phẩm PCR của gen halothane khi sử dụng DNA ly trích từ lơng theo quy trình này.
* Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ DTT
Ngồi proteinase K có khả năng cắt phân tử keratin thì DTT cũng có khả năng phân cắt keratin tốt. Theo Manual của Biorad (2005), DTT có khả năng cắt đứt nối S–S trong phân tử cystein của keratin. Thí nghiệm 2 đƣợc bố trí nhằm mục tiêu khảo sát xem nồng độ nào của DTT thì cho DNA chất lƣợng tốt . Thí nghiệm đƣợc bố trí để so sánh 3 quy trình ly trích: quy trình ly trích 1 sử dụng DTT với nồng độ 50 mM; quy trình 2 sử dụng DTT với nồng độ 65 mM và quy trình 3 sử dụng DTT với nồng độ 80 Mm. Sử dụng proteinase K theo nồng độ đã cho kết quả tốt nhất ở thí nghiệm 1. Các yếu tố khác đƣợc giữ nguyên nhƣ trong thí nghiệm 1. Các bƣớc thực hiện giống nhƣ thí nghiệm 1. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên một yếu tố. Chỉ tiêu khảo sát là tỷ số OD, hàm lƣợng DNA thu hồi và sản phẩm PCR xác định gen halothane. Mẫu sử dụng là mẫu gốc lông heo. Số mẫu thí nghiệm là 4 mẫu cho mỗi quy trình.
22
* Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ CTAB
DTT chỉ phân cắt keratin mà khơng có khả năng loại bỏ đƣợc melanin. Theo Giambernardi và cs (1998), melanin làm ức chế phản ứng PCR. Theo Nozawa và cs (1999), CTAB có thể loại bỏ melanin ra khỏi DNA ly trích. Do đó, thí nghiệm 3 đƣợc bố trí để so sánh chất lƣợng DNA ly trích giữa 3 quy trình: quy trình 1 khơng sử dụng CTAB; quy trình 2 sử dụng CTAB nồng độ 0,1% và quy trình 3 sử dụng CTAB nồng độ 0,2%. Sử dụng DTT theo nồng độ đã cho kết quả tốt nhất ở thí nghiệm 2. Các yếu tố khác đƣợc giữ nguyên nhƣ trong thí nghiệm 2. Các bƣớc đƣợc thực hiện theo trình tự của thí nghiệm 2. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên một yếu tố. Mẫu thí nghiệm là mẫu gốc lơng heo. Số mẫu đƣợc khảo sát là 4 cho mỗi nghiệm thức. Chỉ tiêu khảo sát là tỷ số OD, hàm lƣợng DNA thu hồi, sản phẩm PCR của gen halothane.
3.4.2.2. Áp dụng quy trình ly trích DNA lên các vị trí khác nhau của lơng heo
Để khảo sát xem quy trình ly trích tối ƣu đƣợc rút ra từ những thí nghiệm trên sẽ cho kết quả tốt nhất trên vị trí nào của lơng heo, thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ mơ tả bên dƣới.
* Thí nghiệm 4: Áp dụng quy trình ly trích lên các vị trí khác nhau của lơng
Thí nghiệm 4 đƣợc tiến hành nhằm khảo sát hiệu quả của việc tách chiết DNA theo quy trình tối ƣu trên đối với các vị trí khác nhau của lơng. Từ đó rút ra vị trí tốt nhất trên lơng để ly trích DNA. Thí nghiệm 4 đƣợc thực hiện theo các trình tự của quy trình tham khảo với nồng độ proteinase K, nồng độ DTT, nồng độ CTAB đã cho kết quả ly trích DNA tốt nhất qua các thí nghiệm trên. Thí nghiệm 4 đƣợc bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên một yếu tố. Có 4 lơ thí nghiệm: lơ 1 gồm 10 mẫu gốc lơng, lơ 2 gồm 10 mẫu thân lông, lô 3 gồm 10 mẫu ngọn lông và lô 4 gồm 10 mẫu cả sợi lơng (vị trí lơng đƣợc phân chia theo hình 3.4). Chỉ tiêu khảo sát là tỷ số OD, hàm lƣợng DNA thu hồi, sản phẩm PCR của gen halothane.
3.4.3. Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế
DNA sau khi ly trích đƣợc đo bằng máy quang phổ kế ở bƣớc sóng 260 nm và 280 nm. Độ tinh sạch của DNA đƣợc tính bằng tỷ số OD260nm/OD280nm. DNA đƣợc
Hàm lƣợng DNA đƣợc tính bằng cơng thức: DNA (ng/µl) = (62,9*OD260nm – 36*OD280nm)* độ pha loãng. Mẫu đƣợc pha loãng 100 lần theo tỷ lệ 10 µl DNA gốc:
990 µl H2O khi đo OD.
3.4.4. Thực hiện phản ứng PCR
DNA sau khi đƣợc ly trích từ lơng heo theo các quy trình trên đƣợc sử dụng làm mẫu để thực hiện PCR xác định gen halothane. Kết quả PCR sẽ là một trong những chỉ tiêu để đánh giá chất lƣợng DNA ly trích. Quy trình PCR xác định gen halothane đƣợc tham khảo từ Lƣơng Quý Phƣơng (2006).
Bảng 3.4. Thành phần hỗn hợp PCR xác định gen halothane Thành phần Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thành phần Nồng độ đầu Nồng độ cuối PCR buffer 5 X 1 X MgCl2 25 mM 2 mM F/ R primer 100 µM 0,5 µM dNTP 25 mM 200 µM/ mỗi loại
Taq polymerase 5 UI/µl 1 UI
DNA 150 ng
H2O cất vừa đủ 30 µl
(Nguồn: Lƣơng Quý Phƣơng, 2006)
Bảng 3.5. Chu kỳ nhiệt trong PCR xác định gen halothane
(Nguồn: Lƣơng Quý Phƣơng, 2006)
Tên giai đoạn Nhiệt độ (o
C) Thời gian Biến tính hồn tồn 94 5 phút 35 chu kỳ Biến tính Bắt cặp Kéo dài 94 54 72 45 giây 90 giây 90 giây
Kéo dài cuối cùng 72 5 phút
24
3.4.5. Điện di và quan sát kết quả 3.4.5.1. Chuẩn bị gel agarose 3.4.5.1. Chuẩn bị gel agarose
Nồng độ agarose dùng cho điện di sản phẩm PCR xác định gen halothane là 2%. Ví dụ cần 100 ml dung dịch agarose 2%, tiến hành nhƣ sau:
- Cân 2 g agarose cho vào 100 ml dung dịch TBE 0,5 X - Đun sôi hỗn hợp trên trong 3 phút
- Để nguội dần ở nhiệt độ phòng, đến khi vừa ấm là đƣợc
- Đổ gel vào bể điện di (đặt lƣợc tạo giếng trƣớc khi đổ), chú ý tránh bọt khí - Để cho gel cứng hoàn toàn, rút lƣợc ra khỏi gel. Cho gel vào bể điện di, bổ sung thêm TBE cho ngập bản gel là đƣợc.
- Trộn 10 sản phẩm PCR với 2 loading dye và bơm hỗn hợp vào các giếng gel. Vận hành máy điện di với các thông số 100 V, 250 mA, 30 phút.
- Sau khi điện di, ngâm gel trong ethidium bromide 10 mg/ml trong 30 phút.
3.4.5.2. Đọc kết quả
Điện di 7,5 µl sản phẩm PCR trong 30 phút với TBE 0,5 X ; dòng điện 100 V; 250 mA. Vớt gel ra khỏi buồng diện di và cho vào thùng nhuộm ethidium bromide 10 mg/ml trong 30 phút. Đặt gel lên bàn chụp UV, quan sát kết quả với phần mềm Geldoc của Biorad.
3.5. Xử lý số liệu
Xử lý số liệu với các hàm thống kê F trong Excel và phần mềm Statgraphics 7,0. Kết quả đƣợc trình bày ở dạng X± SE (Với SE = SD/√n ).
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ proteinase K 4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ proteinase K
Sử dụng mẫu gốc lơng để ly trích DNA. Kết quả đo OD và hàm lƣợng DNA đƣợc trình bày trong bảng 4.1.
Bảng 4.1. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các nồng độ proteinase K
Chỉ tiêu Nồng độ proteinase K P 0,8 mg/ml 1 mg/ml 1,2 mg/ml Tỷ số OD 1,84 0,03 1,82 0,03 1,75 0,03 1,71 Hàm lƣợng DNA (µg/µl) 0,32 0,02 0,33 0,03 0,32 0,03 0,28 Số mẫu 4 4 4 1,84 1,82 1,75 0,32 0,33 0,32 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 0,8 mg/ml 1 mg/ml 1,2 mg/ml nồng độ proteinase K Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg/µl)
Biểu đồ 4.1. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các nồng độ proteinase K
McNevin và cs (2005) đã đƣa ra khoảng nồng độ proteinase K sử dụng trong dung dịch đệm ly trích DNA của lơng là từ 0,05 đến 20 mg/ml. Qua bảng 4.1 cho thấy khơng có sự khác biệt về tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi ở các nồng độ 0,8 mg/ml; 1 mg/ml và 1,2 mg/ml (P > 0,05). Phản ứng PCR từ các mẫu trên đều thành
26
cơng. Do đó, khi tiến hành các thí nghiệm ly trích DNA từ lơng, có thể dùng buffer ly trích chứa proteinase K nồng độ 0,8 mg/ml để có lợi về mặt kinh tế.
1 2 3 4
Hình 4.1. Kết quả PCR mẫu gốc lơng ở 3 nồng độ proteinase K 4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ DTT 4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ DTT
Sau khi đo OD và tính hàm lƣợng DNA thu hồi đƣợc từ các mẫu gốc lơng đem thí nghiệm, chúng tơi tính tốn các giá trị thống kê (xem bảng 4.2).
Bảng 4.2. Kết quả tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các nồng độ DTT
Chỉ tiêu Nồng độ DTT P 50 mM 65 mM 80 mM Tỷ số OD 1,65 0,02 1,81 0,09 1,64 0,03 1,67 Hàm lƣợng DNA (µg/µl) 0,36 0,08 0,43 0,04 0,29 0,03 0,40 Số mẫu 4 4 4 1,65 1,81 1,64 0,36 0,43 0,29 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 50 mM 65 mM 80 mM nồng độ DTT Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg/µl)
Biểu đồ 4.2. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các nồng độ DTT 586 bp 586 bp
1: Mẫu gốc lông sử dụng proteinase K 0,8 mg/ml 2: Mẫu gốc lông sử dụng proteinase K 1 mg/ml 3: Mẫu gốc lông sử dụng proteinase K 1,2 mg/ml 4: Mẫu ĐC (DNA ly trích từ cơ)
Khơng có sự khác biệt về tỷ số OD giữa việc sử dụng DTT ở các nồng độ 50 mM, 65 mM và 80 mM (P > 0,05). Phản ứng PCR gen halothane thành cơng ở mẫu có sử dụng nồng độ DTT 50 mM nhƣng không thành công với những mẫu ly trích từ hai nồng độ cịn lại. Sự hiện diện của DTT trong dung dịch đệm ly trích làm giảm rõ rệt lƣợng DNA ly trích (Kalbe và cs, 1988) và điều này có thể làm giảm việc gắn kết giữa các deoxyribose nucleotides trong DNA, làm chúng không thể đƣợc nhận biết bởi Taq
polymerase (McNevin và ctv, 2005). Đó có thể là giả định giải thích tại sao phản ứng PCR không xảy ra đối với mẫu sử dụng nồng độ DTT 65 mM và 80 mM. Do đó, trong buffer ly trích DNA từ lơng nên sử dụng DTT nồng độ 50 mM để cho DNA có chất lƣợng tốt.
1 2 3 4
Hình 4.2. Kết quả PCR mẫu gốc lông ở 3 nồng độ DTT 4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ CTAB 4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ CTAB
Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên mẫu gốc lông. Kết quả đo OD và hàm lƣợng DNA thu hồi đƣợc trình bày trong bảng 4.3.
Bảng 4.3. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các nồng độ CTAB
Chỉ tiêu Nồng độ CTAB P 0% 0,1% 0,2% Tỷ số OD 1,39 0,02 a 1,53 0,03 b 1,80 0,02 c 0,03 Hàm lƣợng DNA (µg/µl) 0,32 0,02 0,37 0,03 0,33 0,04 0,31 Số mẫu 4 4 4 586 bp 1: Mẫu gốc lông sử dụng DTT 50 mM 2: Mẫu gốc lông sử dụng DTT 65 mM 3: Mẫu gốc lông sử dụng DTT 80 mM 4: Mẫu ĐC (DNA ly trích từ cơ)
28 1,39 1,53 1,8 0,32 0,37 0,33 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 0% 0,10% 0,20% nồng độ CTAB Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg/µl)
Biểu đồ 4.3. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các nồng độ CTAB
Có sự khác biệt giữa tỷ số OD giữa các quy trình ly trích sử dụng CTAB ở các nồng độ 0%, 0,1% và 0,2% (P < 0,05). Sử dụng CTAB ở nồng độ 0,2% cho tỷ số OD cao nhất. Phản ứng PCR thành cơng đối với mẫu có sử dụng CTAB ở nồng độ 0,2%. Theo Nozawa và cs (1999), CTAB có khả năng loại bỏ melanin ra khỏi hỗn hợp mẫu lông. Ở những mẫu không sử dụng CTAB và những mẫu có sử dụng CTAB 0,1%, có lẽ nồng độ CTAB sử dụng không đủ để loại hết thành phần melanin trong hỗn hợp mẫu lông. Theo Sambrook và ctv (2001), độ tinh sạch của DNA ảnh hƣởng rất lớn đến hiệu quả PCR. DNA có tỷ số OD từ 1,8 – 2,0 đƣợc xem là sạch. Ở đây, mẫu khơng dùng CTAB và mẫu dùng CTAB 0,1% có tỷ số OD trung bình là 1,39 và 1,53. Tỷ số này thấp, chứng tỏ lƣợng protein trong dịch DNA cịn nhiều. Đó có thể là lý do giải thích cho những phản ứng PCR không thành công ở mẫu không sử dụng CTAB và mẫu sử dụng CTAB 0,1%. Do đó, trong buffer ly trích DNA từ lông nên sử dụng CTAB nồng độ 0,2%.
1 2 3 4
Hình 4.3. Kết quả PCR mẫu gốc lơng ở 3 nồng độ CTAB
4.4. Thí nghiệm 4: Áp dụng quy trình ly trích lên các vị trí khác nhau của lơng
Thí nghiệm đƣợc bố trí trên các lơ mẫu gốc lông, thân lông, ngọn lông và cả sợi lông heo. Kết quả đo OD và hàm lƣợng DNA đƣợc trình bày trong bảng 4.4a.
Bảng 4.4a. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các vị trí của lơng heo
Chỉ tiêu Mẫu p Gốc Thân Ngọn Cả sợi Tỷ số OD 2,05±0,15 a 1,84±0,15 b 1,40±0,15 c 1,75±0,15 b 0,04 Hàm lƣợng DNA (µg/µl) 0,33±0,15 a 0,30±0,15 ab 0,24±0,15 c 0,28±0,15 b 0,03 Số mẫu 10 10 10 10 2,05 1,84 1,4 1,75 0,33 0,3 0,24 0,28 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Gốc Thân Ngọn Sợi Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg/µl)
Biểu đồ 4.4. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các vị trí lơng heo
586 bp
1: Mẫu gốc lông không sử dụng CTAB 2: Mẫu gốc lông sử dụng CTAB 0,1% 3: Mẫu gốc lông sử dụng CTAB 0,2% 4: Mẫu ĐC (DNA ly trích từ cơ)
30
Qua bảng 4.4a cho thấy có sự khác biệt về tỷ số OD trên các vị trí khác nhau của lông heo (P < 0,05). Vị trí cho tỷ số OD tốt nhất là mẫu gốc lông (2,05), tiếp theo là mẫu thân lơng (1,84), vị trí cho tỷ số OD thấp nhất là mẫu ngọn lơng (1,40), vị trí cho tỷ số OD chấp nhận đƣợc là cả sợi lơng (1,75). Ngun nhân có thể là do mức độ keratin hóa ở gốc ít hơn ở ngọn cho nên việc tách keratin ra khỏi hỗn hợp DNA ly trích từ gốc dễ dàng hơn so với phần ngọn.
Kết quả cho thấy hàm lƣợng DNA thu hồi từ mẫu gốc lông đạt cao nhất (0,33 µg/µl). Trong khi đó, mẫu thân lơng đạt 0,3 µg/µl, mẫu cả sợi lơng đạt 0,28 µg/µl và mẫu ngọn lơng là thấp nhất (0,26 µg/µl). Sự khác biệt này rất có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,05). Nguyên nhân có thể là do phần lớn tế bào ở ngọn lông là tế bào chết nên mất hết DNA, vì thế lƣợng DNA thu hồi sẽ ít hơn so với lƣợng DNA thu hồi từ gốc và thân lơng (nơi có nhiều tế bào cịn sống).
Bảng 4.4b. Kết quả PCR từ các vị trí lơng heo Mẫu Số mẫu tiến hành
PCR Số mẫu có sản phẩm PCR Tỷ lệ mẫu có sản phẩm PCR (%) P Gốc lông 10 7 70 0,03 Thân lông 10 6 60 Ngọn lông 10 0 0 Sợi lông 10 5 50
Qua bảng 4.4b cho thấy DNA ly trích từ mẫu gốc lơng cho tỷ lệ thành công của phản ứng PCR cao nhất (70%), tiếp theo là mẫu thân lông (60%) và mẫu cả sợi lông (50%). Mẫu ngọn lơng do tỷ số OD cịn q thấp nên phản ứng PCR không xảy ra (tỷ lệ PCR thành cơng là 0%). Sự khác biệt này là có ý nghĩa (p < 0,05). Trong các nghiên cứu sử dụng mẫu lông của thú sống, việc nhổ cả sợi lơng trên mình thú với số lƣợng lớn sẽ dễ làm cho thú bị stress, ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng, phát triển và sinh sản của thú. Để giải quyết vấn đề này, chúng ta có thể dùng dao cắt những sợi lông ngay trên bề mặt da thú rồi áp dụng quy trình ly trích DNA cho mẫu thân lơng.
Nhƣ vậy, ly trích DNA từ gốc lơng và thân lơng sẽ cho DNA chất lƣợng tốt