a. Tất cả các hạt đều màu đỏ của dòng D2-1-1; b. Hạt màu đỏ (1) và màu trắng (2) của dòng D2-1-4
Các kết quả ghi nhận đƣợc cho thấy đã có sự di truyền của gen biến nạp từ thế hệ T1 đến T2, tất cả các cây T2 đều tạo đƣợc hạt màu đỏ. Ngoài ra, mức độ màu đỏ hạt có thể do ảnh hƣởng của số lƣợng bản sao gen biến nạp hiện diện trong bộ gen hạt, cũng nhƣ vị trí gắn chèn của gen biến nạp trong nhiễm sắc thể cây bố mẹ. Những cây phát triển từ hạt đỏ đậm khơng có sự phân ly màu sắc hạt (đỏ, trắng) ở thế hệ sau, có thể do số lƣợng bản sao của gen biến nạp trong cây bố mẹ nhiều; những cây phát triển từ hạt đỏ nhạt có sự phân ly màu sắc hạt (đỏ, trắng) ở thế hệ sau, có thể do số lƣợng bản sao của gen biến nạp trong cây bố mẹ ít hơn. Do đó màu sắc hạt có thể đƣợc sử dụng để hỗ trợ việc xác định thể đồng hợp tử, từ đó tạo dịng di truyền ổn định gen biến nạp. Nhiều nghiên cứu chuyển gen đã ghi nhận số lƣợng bản sao của gen biến nạp có thể ảnh hƣởng đến mức biểu hiện chung của tính trạng, đặc điểm quan tâm. Shirsat và cộng sự (1989) nhận thấy hàm lƣợng protein ngoại lai legA trong cây N. plumbaginifolia đạt đƣợc ở các mức cao với số lƣợng bản sao
gen biến nạp lớn hơn 1 (khoảng 2-4), chứng tỏ hàm lƣợng protein legA có thể là kết quả của nhiều sự biểu hiện các bản sao gen [184]. Mức độ biểu hiện của gen gfp
trên lúa gạo trong nghiên cứu chuyển gen của Zhou và cộng sự (2013) cũng cho thấy có sự tƣơng quan trong sự biểu hiện của gen biến nạp với số lƣợng bản sao, với các dịng có số lƣợng bản sao cao (2-5) thƣờng có biểu hiện gfp cao hơn các dịng có một bản sao. Tuy nhiên, kết quả khơng hồn tồn tuyến tính do sự biểu hiện gen chuyển cịn phụ thuộc vào vị trí gắn chèn trong nhiễm sắc thể [185]. Nghiên cứu chuyển các gen mã hóa enzyme ferredoxin-hydrogenase và Gaussia-Luciferase vào tảo Chlamydomonas reinhardtii của Shahar và cộng sự cũng ghi nhận các kết quả tƣơng tự [186].
Tóm lại, kết quả từ các thí nghiệm trên cho thấy các gen biến nạp đã đƣợc di truyền và biểu hiện ổn định qua nhiều thế hệ. Tuy nhiên, hai dòng chuyển gen T0 ban đầu (D2 và D8) đều mang hai bản sao của gen biến nạp và chỉ tạo đƣợc hai hạt. Do đó khơng thể phân tích qui luật di truyền của các gen biến nạp ở thế hệ tiếp theo. Ngoài ra, việc thu nhận các dòng thuần, đồng hợp tử gen biến nạp có thể đƣợc thực hiện bằng việc gieo các hạt màu đỏ đậm nhất qua nhiều thế hệ để thu nhận dòng tạo đƣợc các hạt đỏ đậm, đồng đều.
3.11.2.6. Phân t ch hàm lượng astaxanthin trong hạt chuyển gen.
Hàm lƣợng astaxanthin trong hạt đậu màu đỏ của hai dòng chuyển gen D2-1 và D8-1 đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS tại Trung tâm phân tích trƣờng ĐH Khoa học Tự nhiên tp. HCM.
Mẫu ly trích từ hạt của hai dịng D2-1 và D8-1 đều có sự hiện diện peak ở tỉ số khối lƣợng/điện tích (m/z) đặc trƣng của astaxanthin là 597,39 [187][188][189][190], đồng thời ở mẫu đối chứng không chuyển gen khơng có sự hiện diện của peak này, chứng tỏ trong hạt của hai dịng D2-1 và D8-1 đều có astaxanthin (hình 3.35, 3.36, 3.37). Kết quả xác định hàm lƣợng astaxanthin trong hạt đƣợc trình bày trong bảng 3.14.
ảng 3 14 Kết quả định lƣợng astaxanthin trong hạt của các dòng chuyển gen
STT Dòng đậu tƣơng Hàm lƣợng astaxanthin (µg/g) 01 Đối chứng Khơng phát hiện
02 D2-1 0.31
Astaxanthin đƣợc xác định hiện diện trong hạt của các dòng đậu tƣơng chuyển gen, điều này cho thấy cấu trúc ba gen Zm-psy, cbfd2, hbfd1 biến nạp vào
đậu tƣơng đã hoạt động: enzyme ZM-PSY giúp tăng cƣờng con đƣờng chuyển hóa carotenoids (hạt đậu tƣơng chuyển gen đậm màu hơn so với đối chứng); enzyme CBFD2, HBFD1 phối hợp hoạt động qua ba bƣớc, giúp chuyển hóa β-carotene thành astaxanthin. Nhƣ vậy, con đƣờng chuyển hóa tạo astaxanthin ở cây hoa
Adonis aestivalis đã đƣợc ứng dụng thành công vào đậu tƣơng. Tuy nhiên, hàm
lƣợng astaxanthin trong hạt của hai dòng D2-1 và D8-1 đều tƣơng đối thấp (lần lƣợt đạt 0,31 và 0,77 µg/g) so với nghiên cứu chuyển gen tạo astaxanthin trên một số đối tƣợng khác nhƣ ngơ đạt 16,77 µg/g [31]; gạo với 16,23 µg/g [8]; đậu tƣơng với 2-7 µg/g [63]… cũng nhƣ so với ly trích từ nguồn tự nhiên nhƣ tảo Haematococcus pluvialis 20 -50 mg/g trọng lƣợng khô [53][191]; nấm men Xanthophyllomyces dendrorhous 1,14 – 2,57 mg/g trọng lƣợng khơ tế bào [192][193]. Điều này có thể do nhiều nguyên nhân nhƣ khác biệt về nguồn gen sử dụng, loại cây biến đổi gen, hơn nữa các cây chuyển gen chƣa phải thể đồng hợp tử, khả năng hoạt động của gen biến nạp phụ thuộc vào vị trí gắn chèn trong bộ nhiễm sắc thể. Do đó, việc tạo thêm nhiều dịng chuyển gen có thể giúp tìm đƣợc dịng có khả năng tổng hợp astaxanthin tối ƣu hơn. Ngồi ra, con đƣờng chuyển hóa β-carotene thành astaxanthin xúc tác bởi CBFD và HBFD bị cạnh tranh với một enzyme nội sinh khác trong cây là β-ring carotene hydroxylase chuyển hóa β-carotene thành β-cryptoxanthin và zeaxanthin, những hợp chất không thể sử dụng bởi các enzyme CBFD, HBFD. Đây cũng có thể là nguyên nhân ảnh hƣởng đến khả năng hoạt động của CBFD, HBFD làm giảm sự tạo thành astaxanthin. Tuy nhiên, để chứng minh, cần thêm những nghiên cứu nhƣ ức chế hoặc bất hoạt gen mã hóa β-ring carotene hydroxylase [6][19][21].
Hình 3.36. Phổ ESI-MS của mẫu ly trích từ hạt dịng D2-1
Hình 3.37. Phổ ESI-MS của mẫu ly trích từ hạt dịng D8-1
3.11.2.7. Đánh giá sự sinh trưởng cây chuyển gen T0, T1 trong điều kiện ex vitro
Nhìn chung cây đậu tƣơng chuyển gen T0 trồng trong vƣờn ƣơm đạt kích thƣớc tối đa lúc cây ra hoa, đậu quả, có kiểu hình các bộ phận tƣơng tự với cây đối
chứng cấy mô và nhỏ hơn nhiều so với cây đối chứng trồng từ hạt (hình 3.38, bảng 3.15). Các bộ phận của cây chuyển gen phát triển bình thƣờng, lá xanh, gồm 3 lá mỗi nhánh, hình dạng phiến lá bình thƣờng, thân thẳng, hoa màu tím nhạt, hình dạng cánh hoa nhƣ cây đối chứng. Thời gian từ khi trồng đến lúc quả chín, thu hạt khoảng 4 tháng, giống với cây đối chứng. Ngồi kiểu hình, đặc điểm khác biệt lớn giữa cây chuyển gen, đối chứng cấy mô so với cây đối chứng trồng từ hạt là khả năng sinh sản cây chuyển gen, đối chứng cấy mô thấp hơn nhiều so với cây đối chứng trồng từ hạt. Cây chuyển gen chỉ có khả năng đậu 1-2 quả, mỗi quả từ 1-2 hạt. Điều này gây hạn chế lớn đến khả năng thu nhận thể chuyển gen ở các thế hệ sau. Tuy cây chuyển gen T0 có kiểu hình nhỏ, năng suất hạt thấp nhƣng ở thế hệ T1 trồng từ hạt phát triển bình thƣờng cả về kích thƣớc và năng suất. Hạt chuyển gen có màu đỏ, về kích thƣớc khơng khác nhiều so với hạt đối chứng. Màu đỏ chỉ biểu hiện chuyên biệt ở hạt, các bộ phận khác nhƣ thân, lá, hoa màu sắc không bị thay đổi. Các giai đoạn sinh trƣởng, phát triển, ra hoa, đậu trái bình thƣờng nhƣ đối chứng. Một số nghiên cứu chuyển gen vào đậu tƣơng cũng ghi nhận từ thế hệ T1, cây chuyển gen khơng khác biệt về hình thái và năng suất so với cây đối chứng không chuyển gen [122][194]. Sau đây là bảng so sánh một số thơng số kiểu hình, năng suất của cây chuyển gen T0, T1 và đối chứng cấy mô, trồng từ hạt.
ảng 3 15. So sánh một số đặc điểm của cây chuyển gen và đối chứng.
Cây đậu tƣơng Chiều cao (cm) Đƣờng kính thân (mm) Số nhánh Số hạt Đƣờng kính (mm) - trọng lƣợng trung bình của hạt (g) ĐC1 11 1,8 5 4 5,5 (0,12) D2 9 1,6 4 2 5,4 (0,11) D8 8,5 1,4 4 2 5,6 (0,13) ĐC2 73 3,5 11 109 6,7 (0,18) D2-1 76 3,2 10 99 6,5 (0,16) D8-1 71 3,4 11 104 6,8 (0,18)
Hình 3.38. So sánh kiểu hình cây chuyển gen và cây đối chứng.
Cây chuyển gen To (a), đối chứng từ hạt (b), chuyển gen T1 (c) sau 6 tuần; cây chuyển gen To (d), đối chứng (e), chuyển gen T1 (f) sau 14 tuần.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Nội dung 1: Xây dựng hệ thống tạo cây con hoàn chỉnh in vitro từ đốt là mầm và một nửa hạt
Hạt đậu tƣơng đƣợc khử trùng bằng khí clo trong 16 giờ giúp tạo mẫu sạch và giữ khả năng nảy mầm của hạt tốt nhất. BA 2 mg/l là nồng độ tối ƣu để cảm ứng tạo chồi từ đốt lá mầm và một nửa hạt của ba giống MTĐ 176; HL 07-15 và OMĐN 29. Ngoài ra, IBA 1 mg/l và 1,5 mg/l lần lƣợt là nồng độ tối ƣu để cảm ứng tạo rễ từ mẫu chồi của hai giống MTĐ 176; HL 07-15 và giống OMĐN 29.
Nội dung 2: Khảo sát các điều kiện thích hợp để ứng dụng trong qui trình chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng
Nồng độ PPT tối ƣu để chọn lọc chồi chuyển gen của giống MTĐ 176, OMĐN 29 và HL 07-15 lần lƣợt là 6, 5 và 5 mg/l. Ngoài ra, bổ sung PPT từ 1 mg/l trong mơi trƣờng ni cấy có thể giúp duy trì áp lực chọn lọc cho chồi chuyển gen. Kim châm nhiều mũi đƣợc sử dụng để đâm nhẹ 3 lần lên vùng đốt lá mầm sẽ tạo vết thƣơng mẫu phù hợp cho các nghiên cứu chuyển gen.
Mẫu đốt lá mầm đƣợc tạo vết thƣơng bằng dao mổ và kết hợp xử lý với sóng siêu âm 30s hoặc thấm hút chân không 60s (-20 in Hg) sẽ giúp tăng đáng kể hiệu quả chuyển gen gus vào đậu tƣơng, từ 1,67% lên 10% (sóng siêu âm) và từ 1,67%
lên 8,33% (thấm hút chân không).
Nội dung 3: Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens và kiểm tra, đánh giá các dòng đậu tƣơng chuyển gen.
Phƣơng pháp tạo vết thƣơng vùng đốt lá mầm (giống MTĐ 176) bằng cách sử dụng kim châm đâm nhẹ 3 lần để thay thế dao mổ đã giúp tăng hiệu quả chuyển gen tạo astaxanthin từ 0,33% lên 1%. Ngồi ra, việc kết hợp sử dụng sóng siêu âm 30s hoặc thấm chân không 60s (-20 in Hg) trong quá trình tạo vết thƣơng mẫu đốt lá mầm cũng giúp tăng hiệu quả chuyển gen từ 0,67 % lên 2%.
Nghiên cứu đã tạo đƣợc nhiều dòng đậu tƣơng biến đổi gen, trong đó 2 dịng có khả năng tạo hạt và sản xuất astaxanthin chuyên biệt ở hạt. Hàm lƣợng
astaxanthin trong hạt thế hệ T1 của hai dòng đậu tƣơng chuyển gen lần lƣợt là 0,31 µg/g (D2) và 0,77 µg/g (D8). Các dịng đậu tƣơng chuyển gen có khả năng di truyền và biểu hiện gen biến nạp qua nhiều thế hệ. Trong các giai đoạn sinh trƣởng, phát triển cũng nhƣ năng suất hạt cho thấy cây chuyển gen và đối chứng khơng có nhiều khác biệt.
KIẾN NGHỊ
Nghiên cứu đã cho thấy bằng cách sử dụng các phƣơng pháp tạo vết thƣơng mẫu thích hợp nhƣ dùng kim châm đâm nhẹ vùng đốt lá mầm hoặc tạo vết thƣơng có sự kết hợp của sóng siêu âm, thấm hút chân khơng có thể giúp nâng cao đáng kể hiệu quả chuyển gen vào giống MTĐ 176 nên có thể đƣợc áp dụng để tăng hiệu quả chuyển gen vào các giống đậu tƣơng khác.
Phƣơng pháp tạo vết thƣơng bằng kim châm nhiều mũi hoặc tạo vết thƣơng trong qui trình chuyển gen vào đốt lá mầm đã giúp nâng cao đáng kể hiệu quả chuyển gen vào giống đậu tƣơng MTĐ 176 nên có thể đƣợc áp dụng
Các hạt đậu tƣơng màu đỏ đậm cần tiếp tục đƣợc gieo trồng thêm nhiều thế hệ để nhận đƣợc các cây tạo hạt đỏ đậm, khơng phân ly. Sau đó các cây này cần đƣợc đánh giá về khả năng sinh trƣởng, phát triển, năng suất tạo hạt, hàm lƣợng astaxanthin trong hạt nhằm định hƣớng khả năng ứng dụng tạo sản phẩm chứa astaxanthin nguồn gốc tự nhiên.
Việc tăng cƣờng hơn con đƣờng chuyển hóa hƣớng đến sự tạo astaxanthin có thể đƣợc thực hiện thông qua một số định hƣớng nhƣ chuyển thêm gen mã hóa phytoene desaturase, bất hoạt gen mã hóa enzyme lycopene e-cyclase để hƣớng tiền chất vào nhánh β,β hoặc bất hoạt gen mã hóa enzyme β-ring carotene hydroxylase. Mặc dù, một số nghiên cứu tạo cây bắp và lúa biến đổi gen sản xuất astaxanthin đã biến nạp thành công cấu trúc gồm 5 gen, tuy nhiên việc đƣa thêm các yếu tố mới vào cấu trúc 4 gen hiện tại (bar, Zm-psy, cbfd2, hbfd1) cần đƣợc thực hiện lần lƣợt từng yếu tố nhằm đánh giá ảnh hƣởng đến hiệu quả biến nạp gen cũng nhƣ sự biểu hiện ổn định của các gen này.
DANH MỤC CƠNG TRÌNH
1. Hồng Văn Dƣơng, Phan Tƣờng Lộc, Lê Tấn Đức, Nguyễn Huỳnh Cẩm Tú,
Nguyễn Hữu Hổ, Tăng hiệu quả chuyển gen vào cây đậu nành bằng phương
pháp chuyển gen sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens kết hợp sóng siêu âm, thấm chân khơng, Công Nghệ Sinh Học, 2017, 15 (3A), 185-194.
2. Hoàng Văn Dƣơng, Phan Tƣờng Lộc, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Sử dụng kim châm trên đốt lá mầm trong chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo astaxanthin ở cây đậu nành, Công nghệ sinh
học, 2017, 15 (4A), 55-62.
3. Hoàng Văn Dƣơng, Phan Tƣờng Lộc, Lê Tấn Đức, Nguyễn Huỳnh Cẩm Tú,
Trần Thị Ngọc Hà, Nguyễn Hữu Hổ, Tạo cây đậu tương chuyển gen có khả năng sản xuất astaxanthin chuyên biệt ở hạt thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Kỷ yếu Hội Nghị Cơng Nghệ Sinh Học Tồn Quốc 2020, NXB Đại Học Huế, 2020, 22-28.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. G. Goswami, S. Chaudhuri, D. Dutta, The present perspective of astaxanthin with
reference to biosynthesis and pharmacological importance, World Journal of
Microbiology and Biotechnology, 2010, 26 (11), 1925-1939.
2. R.G. Fassett, J.S. Coombes, Astaxanthin: a potential therapeutic agent in cardiovascular disease, Marine drugs, 2011, 9 (3), 447-465.
3. M. Shah, R. Mahfuzur, Y. Liang, J.J. Cheng, M. Daroch, Astaxanthin-producing
green microalga Haematococcus pluvialis: from single cell to high value commercial products, Frontiers in plant science, 2016, 7, 531.
4. A. Molino, J. Rimauro, P. Casella, A. Cerbone, V. Larocca, S. Chianese, D. Karatza, S. Mehariya, A. Ferraro, E. Hristoforou, Extraction of astaxanthin from microalga Haematococcus pluvialis in red phase by using generally recognized as safe solvents and accelerated extraction, Journal of
biotechnology, 2018, 283, 51-61.
5. J.L. Barredo, C. García-Estrada, K. Kosalkova, C. Barreiro, Biosynthesis of astaxanthin as a main carotenoid in the heterobasidiomycetous yeast Xanthophyllomyces dendrorhous, Journal of Fungi, 2017, 3 (3), 44.
6. F.X. Cunningham, E. Gantt, Elucidation of the pathway to astaxanthin in the flowers of Adonis aestivalis, The Plant Cell, 2011, 23 (8), 3055-3069.
7. J.C. Huang, Y.J. Zhong, J. Liu, G. Sandmann, F. Chen, Metabolic engineering of
tomato for high-yield production of astaxanthin, Metabolic engineering, 2013,
17, 59-67.
8. Q. Zhu, D. Zeng, S. Yu, C. Cui, J. Li, H. Li, J. Chen, R. Zhang, X. Zhao, L. Chen, From golden rice to a STARice: bioengineering Astaxanthin biosynthesis in rice endosperm, Molecular plant, 2018, 11 (12), 1440-1448.
9. J. Alcaíno, M. Baeza, V. Cifuentes, Carotenoid distribution in nature,
Carotenoids in Nature, 2016, 3-33.
10. G. Britton, Carotenoid research: History and new perspectives for chemistry in
biological systems, Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell
11. E. Alós, M.J. Rodrigo, L. Zacarias, Manipulation of carotenoid content in plants
to improve human health. Carotenoids in Nature, Springer, 2016, 311-343.
12. D. Gayen, S. Ghosh, S. Paul, S.N. Sarkar, S.K. Datta, K. Datta, Metabolic regulation of carotenoid-enriched golden rice line, Frontiers in plant science,
2016, 7, 1622.
13. X. Zheng, G. Giuliano, S. Al-Babili, Carotenoid biofortification in crop plants:
citius, altius, fortius, Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and
Cell Biology of Lipids, 2020, 1865 (11), 158664.
14. S. Fakhri, F. Abbaszadeh, L. Dargahi, M. Jorjani, Astaxanthin: A mechanistic review on its biological activities and health benefits, Pharmacological
research, 2018, 136, 1-20.
15. S. Davinelli, M.E. Nielsen, G. Scapagnini, Astaxanthin in skin health, repair, and disease: A comprehensive review, Nutrients, 2018, 10 (4), 522.
16. B. Capelli, S. Talbott, L. Ding, Astaxanthin sources: Suitability for human health and nutrition, Functional Foods in Health and Disease, 2019, 9 (6),
430-445.
17. S.H.A. Raza, S.R.Z. Naqvi, S.A. Abdelnour, N. Schreurs, Z.M. Mohammedsaleh, I. Khan, A.F. Shater, M.E. Abd El-Hack, A.F. Khafaga, G. Quan, Beneficial effects and health benefits of Astaxanthin molecules on animal production: A review, Research in Veterinary Science, 2021, 138, 69-