* Nguyên tắc:
Quy trình phát hiện Salmonella cần qua 4 giai đoạn kế tiếp nhau:
(1) Tăng sinh sơ bộ mẫu đã được đồng nhất (370C trong 18+2h) để đảm bảo phát hiện một lượng nhỏ Salmonella hoặc Salmonella đã bị suy giảm hoạt tính.
(2) Tăng sinh chọn lọc trên môi trườngRappaport-Vassiliadis Soya Pepton
(RVS)và Muler Kauffman Tetrathionat/novobioxin (MKTTn).
(3) Phân lập: nhằm tách và nhận dạng Salmonella khỏi các quần thể vi sinh vật khác trong mẫu. Nhiều loại môi trường rắn khác nhau được sử dụng để phân lập Salmonella như Xylose Lysine Desoxycholate (XLD), Salmonella Singella (SS), Bitsmut Sulfit (BS)…mỗi môi trường giúp nhận dạng các loài thuộc giống này dựa trên một vài đặc tính.
(4) Khẳng định: Từ mỗi đĩa chọn ra ít nhất 1 khuẩn lạc điển hình ria cấy trên bề mặt thạch dinh dưỡng để các khuẩn lạc phân lập phát triển tốt, khẳng định bằng các phản ứng sinh hóa và huyết thanh học.
* Các bước tiến hành:
Bước 1. Lấy mẫu theo TCVN 4833 – 1:2002. Bước 2. Đồng nhất mẫu:
Cân chính xác 25 gam mẫu (không lấy mỡ), cắt nhỏ cho vào máy dập mẫu, và bổ sung dần 225 ml dung dịch pepton. (Tốt nhất, đối với vi khuẩn Salmonella thì
dung môi trường BPW (Buffered Pepton Water), nhưng thực tế phòng thí nghiệm chúng tôi dùng dung dịch Pepton). Đem ủ ở 43oc trong khoảng 20 – 24 giờ.
Bước 3. Nuôi cấy tăng sinh:
Dùng pipet vô trùng hút 1ml dung dịch mẫu đã ủ ở trên cho vào 2 dãy ống nghiệm có chứa 10ml môi trường Muler Kauffman Tetrathionat/novobioxin (MKTTn), ủ ở 41,50C trong vòng 24±3h. Hút 1ml dung dịch mẫu cấy vào 10ml môi trường Rappaport-Vassiliadis Soya Pepton (RSV), ủ ở 370C trong 24±3h.
Bước 4. Phân lập vi khuẩn trên các môi trường chọn lọc:
Sử dụng môi trường thạch Salmonella Singella (SS) và môi trường Xylose
Lysine Desoxycholate (XLD).
Lấy một vòng que cấy canh trùng từ môi trường RSV ria cấy trên mặt thạch SS và một vòng que cấy canh trùng từ môi trường MKTTn lên thạch XLD, mỗi loại 2 đĩa, ủ ở 370C trong 24 giờ.
- Môi trường SS dùng để cấy phân lập Salmonella và Shigella. Tác dụng kìm hãm vi khuẩn của muối mật, xanh brillant và natri thiosulfate ngăn cản hoàn toàn sự lan tràn của Proteus, ức chế hẵn sự phát triển của các vi khuẩn gram (+), ức chế một phần các Enterobacteriaceae thuộc giống E.coli.
Sau 24 giờ ủ lấy các đĩa thạch ra kiểm tra khuẩn lạc: khuẩn lạc điển hình của vi khuẩn Salmonella trên các môi trường chọn lọc có dạng hình tròn, trong, bóng láng, đường kính 1 - 2 mm, bờ đều, hơi lồi hoặc dẹt, có hoặc không có tâm đen (dạng S).
- Môi trường XLD: khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có hay không có tâm đen. Một số dòng Salmonella có thể có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc.
Chọn khuẩn lạc điển hình để nhuộm gram, giám định bằng kính hiển vi với vật kính dầu: vi khuẩn Salmonella bắt màu đỏ, hình gậy, mập, ngắn, hai đầu hơi tròn, kích thước 0,7 x 1 - 3 µm.
Bước 5. Giám định tính chất sinh hóa và kết luận:
+ Nuôi cấy trên môi trường thạch sắt đường Trisaccarit (TSI): dùng que cấy đầu thẳng, ria cấy vi khuẩn trên mặt thạch nghiêng sau đó cắm sâu xuống đáy theo đường thẳng đứng, ủ ở 37oc sau 24 giờ lấy ra đọc kết quả.
Nếu đúng là vi khuẩn Salmonella trên mặt thạch nghiêng có màu đỏ (do
Salmonella không phân giải Lactose, Saccrose), thân và đáy có màu vàng, có bọt
khí hoặc vết nứt (do Salmonella phân giải Glucose và sinh hơi), có màu đen xuất hiện (do Salmonella sinh H2S).
+ Nuôi cấy trên môi trường thạch Ure (Christensen): ria cấy vi khuẩn trên mặt thạch nghiêng, ủ 37oc trong 24 giờ. Sau đó lấy ra đọc kết quả.
Kết quả: Phản ứng dương tính môi trường chuyển thành màu đỏ, âm tính môi trường không đổi màu.
Salmonella có phản ứng phân giải Ure âm tính nên môi trường không đổi màu. Salmonella có phản ứng β - galactosidase âm tính nên môi trường không chuyển màu.
+ Thử phản ứng Indol:
Cấy vi khuẩn vào môi trường nước Pepton glucose, ủ 37oc trong 48 giờ. Chuyển 1 ml canh trùng sang ống nghiệm khác, rồi nhỏ dung dịch α – naphtol; 0,2 ml dung dịch KOH 40% lắc đều, để yên 5 – 10 phút đọc kết quả. Phản ứng dương tính môi trường có màu đỏ hồng, âm tính không màu hoặc màu vàng nhạt.
Salmonella có phản ứng VP âm tính.
Căn cứ vào kết quả giám định tính chất sinh hóa để kết luận sự có mặt của vi khuẩn Salmonella trong thực phẩm.
PHẦN 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN