Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Thiết kế nghiên cứu

Đề tài được thiết kế theo phương pháp nghiên cứu mơ tả cắt ngang.

2.2.2. Cỡ mẫu tối thiểu

Cỡ mẫu nghiên cứu được tính theo cơng thức tính dành cho nghiên cứu mơ tả cắt ngang của Tổ chức Y tế thế giới: n = ^Z 2 1- /2 p(1-p) = ^1,96 2 x 0,27x(0,73) = 302,8 d² 0,05² Trong đĩ: n: cỡ mẫu

p: tỉ lệ % CTBG biểu hiện p53 dương tính qua phương pháp HMMD. d: độ chính xác tuyệt đối mong muốn.

Z²1- /2: giá trị 2 phía của phân phối chuẩn tương ứng với ý nghĩa mong muốn. Trong nghiên cứu này chúng tơi chọn  = 0,05 và độ tin cậy là 95%, tương đương với Z1-/2 = 1,96.

Tỉ lệ biểu hiện của đột biến gen p53 qua phương pháp HMMD trên tồn thế giới khoảng 27% [25]. Trong nghiên cứu này, chúng tơi muốn tìm hiểu sâu về biểu hiện của p53 qua phương pháp HMMD trên CTBG, nên chúng tơi chọn p = 27%.

Sau khi đưa trị số p vào cơng thức tính cỡ mẫu, chúng tơi ước tính cỡ mẫu tối thiểu cho nghiên cứu này là 303 bệnh nhân. Nghiên cứu này được thực hiện trên 313 bệnh nhân, nhiều hơn số mẫu cĩ ý nghĩa thống kê.

2.2.3. Phương pháp chọn mẫu:

Các đối tượng được chọn vào mẫu nghiên cứu theo phương pháp chọn mẫu theo chủđích.

2.2.4. Phương tiện kỹ thuật

Tất cả các bệnh phẩm trong nghiên cứu đều được xử lý mơ bằng hệ thống máy Citadel hay Microm tại bộ mơn Giải phẫu bệnh.

Tất cả các mẫu trong nghiên cứu đều được nhuộm HMMD bằng máy Benchmark XT của hãng Ventana và do tác giảđánh giá với sự cố vấn trực tiếp của 2 chuyên gia về HMMD là PGS.TS Hứa Thị Ngọc Hà và GS.TS Nguyễn Sào Trung.

Các kháng thể được dùng trong nghiên cứu này là kháng thể đơn dịng. Kháng thể được sử dụng để nhuộm hố mơ miễn dịch xác định biểu hiện của p53 gián tiếp trên protein p53 là kháng thể đơn dịng DO-07 của hãng Dako (Đan Mạch). Kháng thể DO-07 được sử dụng trong nghiên cứu này cĩ thể nhận diện cả protein p53 tự nhiên và protein p53 đột biến. Tuy nhiên, khơng như protein p53 đột biến cĩ thời gian bán hủy dài, p53 tự nhiên cĩ thời gian bán hủy nhanh (khoảng 20 phút) nên khi cĩ biểu hiện dương tính trên hĩa mơ miễn dịch chứng tỏ cĩ đột biến p53. Kháng thể được sử dụng để nhuộm hố mơ miễn dịch xác định biểu hiện của Ki-67 là Mib-1 của Dako, được nhiều nghiên cứu sử dụng do độ nhạy, chuyên biệt cao [13], [30].

2.2.5. Các bước tiến hành nghiên cứu

Sử dụng mẫu phiếu thu thập dữ liệu ghi nhận thống nhất các dữ liệu của bệnh nhân (phụ lục phiếu thu thập dữ liệu).

Thu thập các thơng tin cần thiết từ hồ sơ bệnh án của các trường hợp nghiên cứu từ kho lưu trữ hồ sơ của bệnh viện Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh, gồm:

+ Tuổi, giới

+ Tình trạng nhiễm vi rút viêm gan + Nồng độ AFP/ huyết thanh

+ Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng khác (Child-Pugh, siêu âm, CT-scan, men gan, bilirubin, PT)

+ Địa chỉ và sốđiện thoại liên lạc của bệnh nhân.

Bệnh phẩm phẫu thuật được cốđịnh trong dung dịch formol 10% đệm trung tính, sau đĩ được cắt lọc lấy 2 mẫu mơ u, mẫu mơ gan lành xung quanh u cách u tối thiểu 1cm và bờ phẫu thuật. Sau cắt lọc bệnh phẩm, các mẫu mơ sẽ được xử lý mơ bằng máy xử lý mơ Citadel hay Microm và đúc khối nến, cắt mỏng tiêu bản với độ

dày 3-5m. Các tiêu bản đều được nhuộm Hematoxylin-Eosin (HE) để khảo sát đặc điểm giải phẫu bệnh vi thể. Một số trường hợp khĩ chẩn đốn trên HE sẽ được nhuộm thêm PAS, Reticulin, Perl, Trichrome, CEA, EMA, CK7, CK20, CD34. Tiến hành nhuộm HMMD p53, Ki-67 tất cả 313 trường hợp nghiên cứu trên mơ u và mơ gan lành xung quanh u bằng máy nhuộm HMMD tự động Benchmark XT của hãng Ventana, được chuyên gia từ Singapore cài đặt chương trình và tối ưu hĩa qua nhiều lần nhuộm thử với các nồng độ kháng thể khác nhau.

2.2.6. Kỹ thuật nhuộm hĩa mơ miễn dịch

Chuẩn bị tiêu bản : cắt mỏng mẩu mơ 3 –5µm và đặt vào lam cĩ mang điện tích dương.

Quá trình thực hiện nhuộm HMMD tự động bằng máy được thực hiện qua các bước sau :

+ Khởi động máy vi tính, máy hố mơ tựđộng, máy in mã vạch + Chạy chương trình điều khiển chung đã được cài đặt sẵn cho máy + Cài chương trình xử lý và thực hiện qui trình nhuộm HHMD cho máy + Chọn kháng thểđể nhuộm : kháng thể kháng p53 và Ki-67

+ Máy sẽ khử parafin bằng dung dịch Ezpred (dung dịch chuyên dụng cho máy Benchmart XT)

+ Máy tiếp tục giai đoạn bộc lộ kháng nguyên bằng dung dịch CC1 ở 95⁰C trong thời gian 30 phút.

+ Cho kháng thể vào từng lam với từng loại kháng thể thích hợp, tỷ lệ kháng thểở mỗi loại là khác nhau. Tuy nhiên, qua quá trình chạy thử qui trình nhuộm tự động, chúng tơi thấy độ pha lỗng kháng thể cho p53 và Ki-67 là tương tự nhau (1 :50). Thời gian ủ của kháng thể là 32 phút. + Máy tựđộng nhuộm bằng DAB Kit

+ Sau khi máy chạy xong, lấy tiêu bản ra và rửa bằng xà phịng để loại bỏ lớp dầu LCS phủ trên tiêu bản. Sau đĩ nhuộm qua Hematoxylin. Dán lamen.

+ Giữa các bước đều cĩ quá trình rửa bằng dung dịch đệm với thời gian 5 phút.

Mỗi đợt nhuộm luơn cĩ 2 tiêu bản chứng được nhuộm kèm theo gồm cĩ:

+ Một tiêu bản chứng dương chứa mẫu mơ đã biết cĩ chứa kháng nguyên cần tìm cho phản ứng dương tính.

+ Một tiêu bản chứng âm khơng được phủ kháng thể thứ nhất mà thay bằng dung dịch đệm PBS.

2.2.7. Phương pháp đánh giá kết quả và xử lý số liệu 2.2.7.1. Đánh giá đặc điểm đại thể của khối u

Đo kích thước và tính số lượng u khi nhận mẫu bệnh phẩm (CTBG) mổ mở. Đối với bệnh nhân cĩ nhiều khối u, khối u cĩ kích thước lớn nhất sẽđược chọn để khảo sát. Vị trí u được ghi nhận qua kết quả siêu âm lấy từ hồ sơ bệnh án.

2.2.7.2. Đánh giá đặc điểm vi thể của khối u

+ Xâm nhập mạch máu vi thể: dựa vào hình ảnh xâm nhập của tế bào ung thư vào mạch máu (động mạch, tĩnh mạch, mạch lymphơ) trên tiêu bản nhuộm HE.

+ Mức độ dị dạng nhân: được đánh giá theo tiêu chuẩn Edmondson- Steiner [33], [34], [35].

+ Độ biệt hĩa: được đánh giá theo tiêu chuẩn phân độ biệt hĩa của WHO [54].

+ Phân loại theo cấu trúc mơ học: loại đặc, loại bè, loại giả tuyến, loại sợi mảnh, loại xơ hĩa, loại hỗn hợp. Nếu nhiều loại phối hợp trên một khối u thì

tính theo loại chiếm ưu thế nhất, loại mơ học nào chiếm hơn 75% mơ u thì tính cho loại mơ học đĩ, nếu cĩ nhiều hơn 2 loại chiếm hơn 25% và dưới 75% mơ u thì xếp vào loại hỗn hợp.

+ Phân loại theo loại tế bào u: loại cổ điển, loại tế bào sáng, loại phồng bào, loại tế bào hình thoi, loại tế bào khổng lồ. Nếu nhiều loại phối hợp trên một khối u thì tính theo loại chiếm ưu thế nhất, loại mơ học nào chiếm hơn 75% mơ u thì tính cho loại mơ học đĩ, nếu cĩ nhiều hơn 2 loại chiếm hơn 25% và dưới 75% mơ u thì xếp vào loại hỗn hợp.

+ Phân bào: được tính trên 10 quang trường phĩng đại 400 lần, quan sát ở vùng nhiều tế bào ung thư nhất. Nếu >10 phân bào/10 quang trường phĩng đại 400 lần được xem là mức độ phân bào cao, nếu <10 phân bào/10 quang trường phĩng đại 400 lần là mức độ phân bào thấp.

+ Hoại tử u: được quan sát trên tất cả các tiêu bản cĩ mơ u, nếu cĩ vùng hoại tử u thì được ghi nhận là cĩ hoại tử u, nếu hoại tử từng tế bào u hay tế bào u chết theo chương trình thì khơng được tính là hoại tử u.

2.2.7.3. Đánh giá đặc điểm vi thể của mơ gan lành xung quanh u

Nhuộm HE, trichrome, PAS, reticulin để đánh giá tình trạng nghịch sản, viêm gan, xơ gan trên mơ gan xung quanh u, cách xa u trên 1cm. Tình trạng viêm và xơ hĩa theo thang điểm HAI gồm các đặc điểm: hoại tử quanh khoảng cửa, hoại tử quanh tĩnh mạch trung tâm, hoại tử trong tiểu thùy, viêm khoảng cửa, giai đoạn xơ hĩa.

Chúng tơi đánh giá mức độ viêm gan và giai đoạn xơ hĩa dựa theo chỉ số hoạt tính mơ học Knodell-Ishak ( Ishak Modified HAI) [63]:

+ Mức độ viêm

HOẠI TỬ QUANH KHOẢNG CỬA Điểm

Khơng cĩ 0

Nhẹ (khu trú, một vài khoảng cửa) 1

Nhẹ/vừa (khu trú, nhiều khoảng cửa) 2

Vừa (liên tục < 50% chu vi các khoảng cửa hoặc dải xơ) 3 Nặng (liên tục > 50% chu vi của khoảng cửa hoặc dải xơ) 4

HOẠI TỬ QUANH TĨNH MẠCH TRUNG TÂM TIỂU THÙY Điểm

Khơng cĩ 0

Hoại tử khu trú 1

Hoại tử quanh tĩnh mạch trung tâm vài nơi 2

Hoại tử quanh tĩnh mạch trung tâm hầu hết các nơi 3 Hoại tử quanh tĩnh mạch trung tâm + rải rác hoại tử bắc cầu giữa khoảng

cửa và tĩnh mạch trung tâm ⁴

Hoại tử quanh tĩnh mạch trung tâm + nhiều hoại tử bắc cầu giữa khoảng

cửa và tĩnh mạch trung tâm ⁵

Hoại tử tồn bộ tiểu thùy hoặc đa tiểu thùy 6

HOẠI TỬ TRONG TIỂU THÙY Điểm

Khơng cĩ 0

1 ổ/ độ phĩng đại 100 1

2-4 ổ/ độ phĩng đại 100 2

5-10 ổ/ độ phĩng đại 100 3

 10 ổ/ độ phĩng đại 100 4

VIÊM KHOẢNG CỬA Điểm

Khơng 0

Nhẹ, một vài hoặc tất cả khoảng cửa 1

Vừa, một vài hoặc tất cả khoảng cửa 2

Vừa/nặng, tất cả khoảng cửa 3

+ Giai đoạn xơ hĩa

XƠ HĨA Điểm

Khơng hĩa sợi 0

Hĩa sợi lan rộng ở một vài khoảng cửa, ± dải sợi ngắn 1 Hĩa sợi lan rộng ở hầu hết các khoảng cửa, ± dải sợi ngắn 2 Hĩa sợi lan rộng ở hầu hết các khoảng cửa với rải rác dải xơ bắc cầu giữa

2 khoảng cửa (cửa-cửa)

3

Hĩa sợi lan rộng ở các khoảng cửa với nhiều dải xơ bắc cầu giữa 2 khoảng cửa, khoảng cửa và tĩnh mạch trung tâm (cửa-cửa; cửa-tĩnh mạch trung tâm)

4

Nhiều dải xơ bắc cầu giữa 2 khoảng cửa hoặc khoảng cửa và tĩnh mạch trung tâm với nốt xơ khơng hồn tồn

5

Xơ gan 6

+ Liên quan giữa tổng số điểm và mức độ hoạt tính của viêm

Mức độ viêm Tổng điểm Khơng 0 Tối thiểu 1-4 Nhẹ 5-8 Vừa 9-12 Nặng 13-18

2.2.8. Đánh giá kết quả nhuộm HMMD

Tế bào được xem là nhuộm dương tính với p53, Ki-67 khi nhân tế bào bắt màu vàng nâu, bất kể cường độ bắt màu là đậm hay nhạt. Chúng tơi ghi nhận cả biểu hiện của p53 và Ki-67 trên cả tế bào ung thư và tế bào gan lành xung quanh khối u.

Về mức độ nhuộm dương tính:

Mức độ dương tính được đánh giá dựa trên tỉ lệ % số tế bào u bắt màu trên tổng số tế bào u cĩ trên tiêu bản. Cĩ nhiều thang điểm đánh giá biểu hiện của p53, Ki-67, trong nghiên cứu này chúng tơi đánh giá theo thang điểm được nhiều tác giả sử dụng nhất hiện nay [13], [30], [60], [67], [100], [103], [119], [120], [149].

Cách đánh giá p53:

Âm tính: nhân khơng bắt màu hoặc ≤10% bắt màu Dương tính: 1(+), 2(+), 3(+)

1(+): nhân bắt màu từ 11-30% 2(+): nhân bắt màu từ 31%-50% 3(+): nhân bắt màu từ 51% - 100%

Cách đánh giá Ki-67

Âm tính (hay tăng sinh tế bào thấp): nhân bắt màu ≤ 20% Dương tính (hay tăng sinh tế bào cao): nhân bắt màu > 20%

2.2.9. Xử lý số liệu

Thu thập số liệu theo phiếu thu thập (phụ lục), phân tích và tổng hợp số liệu. Số liệu nghiên cứu trong các phiếu thu thập dữ liệu được mã hĩa thành các biến số để quản lý và phân tích bằng phần mềm thống kê SPSS 15.0.

Các dữ liệu chính trong nghiên cứu gồm cĩ:

+ Tuổi: tính từ thời điểm bệnh nhân phẫu thuật trừđi ngày tháng năm sinh, là dữ liệu định lượng, thuộc thang đo tỉ lệ.

+ Giới: là dữ liệu định tính, là biến số nhị giá (nam hoặc nữ) thuộc thang đo phân loại.

+ Tình trạng nhiễm vi rút viêm gan B, C, cùng nhiễm vi rút viêm gan B và C, khơng nhiễm vi rút viêm gan là là dữ liệu định tính, thuộc thang đo phân loại.

+ Nồng độ AFP/ huyết thanh: là dữ liệu định lượng, thuộc thang đo tỉ lệ. + Kích thước u: là dữ liệu định lượng, thuộc thang đo tỉ lệ.

+ Vị trí u: là dữ liệu định tính, thuộc thang đo phân loại. + Số lượng u: là dữ liệu định lượng, thuộc thang đo tỉ lệ.

+ Mức độ dị dạng nhân, độ biệt hĩa: là dữ liệu định tính, thuộc thang đo thứ bậc.

+ Phân loại theo cấu trúc mơ học, phân loại theo loại tế bào u, loại bờ khối u, tình trạng viêm trong u: đều là dữ liệu định tính, thuộc thang đo phân loại.

+ Xâm nhập mạch máu vi thể, phân bào, hoại tử u, tình trạng nghịch sản ở mơ gan lành xung quanh khối u: là dữ liệu định tính, thuộc thang đo phân loại.

+ Mức độ viêm và tình trạng xơ hĩa của mơ gan lành xung quanh khối u: là dữ liệu định tính, thuộc thang đo khoảng.

+ Biểu hiện dương tính hay âm tính của p53, Ki-67: là dữ liệu định tính, thuộc thang đo phân loại.

+ Mức độ biểu hiện của p53: là dữ liệu bán định lượng nhưng phân tích như 1 dữ liệu định tính, thuộc thang đo khoảng.

Các biến số trong nghiên cứu được tính tỉ lệ, trị số trung bình, trung vị, xác định kiểu phân phối. So sánh tuổi trung bình của 2 nhĩm viêm gan B và C, tỉ lệ của biến số trong nghiên cứu với tỉ lệ của biến sốđĩ trong các nghiên cứu tham khảo để đánh giá sự khác biệt bằng phép kiểm Student. Khảo sát các mối liên quan giữa các biến số bằng phép kiểm 2. Các biến được xác định cĩ liên quan qua phép kiểm 2 sẽđược phân tích sự tương quan bằng hệ số tương quan Pearson (giữa các dữ liệu thu thập ở thang đo định lượng như tuổi, AFP, kích thước) và hệ số tương quan Spearman (giữa các dữ liệu thu thập ở thang đo thứ bậc hay thang đo phân loại như mức độ biểu hiện của p53, độ biệt hĩa, …). Liên quan được xem là cĩ ý nghĩa khi phép kiểm cĩ p<0,05. Các thống kê được thực hiện với độ tin cậy 95% (1-), với sai lầm là 0,05.

2.2.10. Khía cạnh y đức trong nghiên cứu

Nghiên cứu này khơng vi phạm vấn đề y đức do mẫu khảo sát là mẫu mơ bệnh phẩm ở những bệnh nhân đã được phẫu thuật, các dữ liệu lâm sàng, cận lâm sàng khác được thu thập từ hồ sơ bệnh án. Kết quả nghiên cứu khơng được sử dụng

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Các đặc điểm cĩ ý nghĩa tiên lượng của CTBG

3.1.1. Đặc điểm lâm sàng & cận lâm sàng 3.1.1.1. Tuổi

Trong 313 truờng hợp CTBG cĩ độ tuổi trung bình là 54,8. Độ lệch chuẩn là 12,9. Tuổi lớn nhất là 84 tuổi, tuổi nhỏ nhất là 11 tuổi. Độ tuổi thường gặp nhất là 50-59 tuổi. Nhĩm bệnh nhân cĩ tuổi nhỏ hơn 60 chiếm tỉ lệ 64,9% (203/313), nhĩm bệnh nhân CTBG cĩ tuổi lớn hơn 60 chiếm tỉ lệ 35,1% (110/313) (Biểu đồ 3.1).

2.6% 12.5% 17.3% 32.6% 20.1% 13.4% 1.6% 0.0% 5.0% 10.0% 15.0% 20.0% 25.0% 30.0% 35.0% <30 30- 39 40- 49 50- 59 60- 69 70- 79 80- 89 tỉ lệ CTBG Biểu đồ 3.1. Phân bố tuổi của CTBG

3.1.1.2. Giới 0.3% 2.2% 8.3% 0.3% 16.9% 5.1% 27.5% 8.0% 12.1% 4.2% 9.3% 0.6% 1.0% 0.0% 5.0% 10.0% 15.0% 20.0% 25.0% 30.0% <30 30-39 40-49 50-59 60-69 70-79 80-89 nữ nam Biểu đồ 3.2: Phân bố giới & tuổi của CTBG

Trong 313 truờng hợp CTBG cĩ 71 nữ, 242 nam, tỉ lệ nam/nữ là 3,4/1. CTBG xảy ra nhiều nhất ở lứa tuổi 50 - 59. Riêng nữ CTBG xảy ra nhiều nhất ở lứa tuổi 60-69 tuổi. Cĩ sự khác biệt giữa nam và nữ ở lứa tuổi ≥ 60 tuổi và < 60 tuổi tỉ