1.2.1. Cấu trúc của gen p53
Hiện nay người ta biết đến nhiều gen đè nén u gồm APC, BRCA1, BRCA2, NF1, NF2, WT1, VHL, nhưng chỉ gen RB và p53 cĩ ảnh hưởng đặc biệt đến bộ máy chu kỳ tế bào. Trong đĩ, đột biến gen trên p53 chiếm tỉ lệ khoảng 50% các trường hợp ung thư [136].
Gen p53 gồm 11 exon (exon đầu tiên khơng mã hĩa), nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể số 17 (17p13) (Hình 1.12). Phiên bản RNA thơng tin dài khoảng 3kb, bao gồm 1179 khung đọc mở (ORF)[66]. Theo Bourdon và c.s. [19], gen p53 cĩ 2 vùng bắt đầu phiên mã ở exon 1, và vùng cắt intron khác cĩ thể xuất hiện ở intron 2 và giữa exon 9 và exon 10. Gen này cũng gồm một vùng khởi động nội sinh và vùng bắt đầu phiên mã ở intron 4.
Hình 1.12: Cấu trúc gen p53 [135]
1.2.2. Protein p53
Protein p53 gồm cĩ 393 acid amin, cĩ khối lượng phân tử là 53kD, là protein cĩ hàng loạt các biến đổi sau dịch mã như phosphoryl hĩa, acetyl hĩa, ubiquitin hĩa, sumoy hĩa, neddy hĩa. Protein p53 được chia thành 3 phần chính gồm đầu amino, vùng trung tâm p53, đầu cacboxyl (Hình 1.13). Đầu amino cĩ hai vùng chính là vùng kích hoạt phiên mã TAD1 từ acid amin thứ 1- 42 và TAD2 gồm các acid amin từ 43-63. và một vùng khác là vùng giàu Proline từ acid amin 64-93 [25]. Vùng trung tâm p53 là vùng gắn kết DNA đặc hiệu (DBD) từ vị trí acid amin 102- 292 [110], [113]. Đầu cacboxyl của p53 bao gồm 3 vùng tín hiệu định vị nhân (NLS), vùng tetramer hĩa từ acid amin 325-355 cĩ chứa vùng tín hiệu rời nhân (NES), và vùng điều hịa âm tính [123].
Hình 1.13: Cấu trúc protein p53 [135]
1.2.3. Hoạt động của p53
Gen p53 hoạt động dựa trên hoạt động của nhiều gen khác nhau và các sản phẩm gen của nĩ nhằm đáp ứng lại các tín hiệu stress đa dạng bao gồm apoptosis, sự lão hĩa tế bào, hay sự ngừng chu kỳ tế bào. Các gen điều hịa p53 cũng sản xuất ra các protein truyền tải các tín hiệu stress này đến các tế bào lân cận, ngăn cản hoặc sửa chữa các DNA bị sai hỏng và tạo ra vịng đáp ứng ngược giúp tăng cường hay làm giảm hoạt tính của p53 [83], [84], [87].
Khi nhận các thơng báo từ các nhân tố trung gian và trung tâm điều hịa của chuỗi tương tác p53. Cĩ vài dạng tín hiệu stress được tế bào nhận diện rồi truyền tải đến protein p53 và các thành phần trong trung tâm điều hịa chức năng p53 thơng qua các nhân tố trung gian. Vài tín hiệu stress làm cho protein MDM-2 (gen MDM- 2 là gen điều hịa phiên mã âm tính chủ yếu của p53 trong tế bào) bị phân hủy và kéo theo làm tăng số lượng và hoạt tính của protein p53. Mức độ protein MDM-2 sau đĩ được phục hồi nhờ các phiên bản ức chế p53 của gen MDM-2. Khi lượng p53 tăng lên sẽ làm tăng lượng MDM-2, lúc đĩ, lượng p53 lại bị giảm xuống. Các tương tác xuơi dịng của một loạt gen và các sản phẩm gen được điều hịa bởi protein p53, đa số bằng hoạt tính phiên mã nhưng trong một vài trường hợp bằng tương tác protein-protein. Các gen được p53 điều hịa khác cĩ chức năng truyền tải tín hiệu trả lời đến các tế bào lân cận, sửa chữa DNA hoặc cài đặt vịng điều hịa ngược âm tính hay dương tính, làm tăng cường hay giảm chức năng của protein p53
Đầu amino Vùng trung tâm Đầu cacboxyl
Vùng kích hoạt phiên mã (TAD) Vùng giàu Proline Vùng kết hợp DNA đặc hiệu (DBD) Vùng tetramer hĩa (TET) Vùng điều hịa âm tính (REG)
và kết hợp các đáp ứng stress với những chuỗi tương tác các tín hiệu biểu hiện tính trạng khác. Các đáp ứng tế bào của những tương tác xuơi dịng, bao gồm sự ngừng chu kỳ tế bào, sự lão hĩa tế bào hay apoptosis và thường hình thành hệ thống thơng tin rộng lớn với những chuỗi tương tác các tín hiệu biểu hiện tính trạng khác. Protein p53 được xem như là nhân tố kích hoạt phiên mã của các gen được p53 điều hịa [83], [84].
Các đáp ứng p53 nhạy với sự kích hoạt đột biến của các oncogene và thường thay đổi các biểu hiện đáp ứng xuơi dịng của chuỗi tương tác p53 từ sự ngừng chu kỳ tế bào thành apoptosis. Các tín hiệu stress nội bào đa dạng đều tác động vào trung tâm điều hịa và các nút tương tác đơn lẻđể đáp ứng lại các stress tương ứng. Các stress này được xem là tín hiệu xấu của cả hệ thống cĩ thể dễ dàng làm tổn thương, làm mất đi các nút tương tác trung tâm đơn lẻ [148]. Vì tất cả các stress đều tạo ra sự thiếu chính xác trong quá trình tự nhân đơi, dẫn đến bệnh ung thư, nên protein p53 được xem là một thành phần trung tâm quyết định sự sinh trưởng hoặc sự sinh sản của tế bào [83], [84].
1.2.4. Các phương pháp phân tích sự biến đổi gen p53 trong ung thư
1.2.4.1.Phân tích di truyền phân tử
Đối với gen p53, giải trình tự trực tiếp sau khi PCR khuếch đại gen là một “Tiêu chuẩn vàng” trong các phương pháp phân tích di truyền phân tử. Vì gen p53 cĩ 10 exon mã hĩa cĩ kích thước nhỏ hơn 350 cặp base, nên các trình tự ngắn này được khuếch đại và giải trình tự một cách dễ dàng. Thêm vào đĩ, đột biến gen p53 chủ yếu là các đột biến điểm, cịn các đột biến mất một phần hay tồn phần gen thường ít xảy ra. Tuy nhiên, tính chính xác và độ nhạy của phương pháp này cịn phụ thuộc vào loại khối u và tỉ lệ gây nhiễm mẫu [135].
Ngồi việc sử dụng DNA làm đối tượng nghiên cứu, một số tác giả cũng nhận diện các đột biến di truyền trên RNA, cDNA, đặc biệt là với các loại ung thư
máu. Ở gen p53, việc sử dụng RNA làm vật liệu để phân tích các đột biến cĩ những ưu thế sau: (1) vùng mã hĩa của gen p53 khá nhỏ, chỉ khoảng 1,200 cặp base nên dễ dàng phân tích trọn vẹn gen; (2) nhận diện đột biến trên RNA nhạy hơn trên DNA; (3) khi dùng RNA, cĩ thể nhận diện được các đột biến xảy ra ở các vị trí cắt intron mà khi dùng DNA khơng thể nào nhận diện được. Trong khi hiện nay, việc đánh giá tần số xuất hiện của dạng đột biến này cịn rất hạn chế.
Hiện nay, một cách tiếp cận mới phát triển từ phương pháp giải trình tự của Sanger là phương pháp giải trình tự do nhiệt (pyrosequencing), khơng cần sử dụng bước điện di. Đây là phương pháp phân tích đột biến trên p53 khá thành cơng, tuy nhiên vẫn cịn một số nhược điểm, đặc biệt là các đột biến dịch khung được nhận diện chưa đáng tin cậy và các đoạn DNA phân tích phải cĩ kích thước nhỏ hơn 100 cặp base [135].
1.2.4.2.Thử nghiệm chức năng FASAY (Thử nghiệm chức năng ở nấm men)
Ban đầu, thử nghiệm này dùng để xác nhận đột biến giao tử, sau đĩ được cải tiến và hiện nay, độ nhạy của phương pháp này thích hợp để nhận diện mọi đột biến trên các mẫu mơ ung thư. Trong phương pháp này, cDNA li trích từ mẫu mơ ung thưđược khuếch đại vùng codon 52 đến 364 (68% vùng exon 4 đến 10) bằng PCR, sau đĩ cho biến nạp các gen này vào nấm men. Trong nấm men, đoạn gen này được tái tổ hợp vào hệ gen nấm men và được biểu hiện nhờ vector biểu hiện. Các khuẩn lạc nấm men cĩ chứa các gen p53 bị đột biến sẽ cĩ màu đỏ trên mơi trường, trong khi các khuẩn lạc trắng cho thấy cấu trúc gen p53 bình thường. Đoạn gen khuếch đại mang đến 95% các đột biến, làm cho thử nghiệm FASAY trở thành phương pháp phân tích p53 hữu hiệu, đặc biệt là đối với các đột biến ở vùng cắt intron. Ngồi ra, để thử nghiệm này thành cơng, chỉ cần cĩ khoảng 5% tế bào ung thư trong mẫu mơ, và thường để nhận diện các đột biến khơng thể nhận diện được qua giải trình tự trực tiếp. Tuy nhiên, phương pháp này lại khơng cho biết thơng tin cụ thể về dạng đột biến nào đã xảy ra. Thêm vào đĩ, các thểđột biến p53 rất nhạy với sự biến
đổi nhiệt độ và sự biểu hiện các đột biến giống nhau lại rất khác nhau, phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện mơi trường sống và chất cảm ứng cĩ trong mơi trường nuơi cấy [135].
1.2.4.3. Phân tích huyết thanh các biến đổi gen p53
Trong khoảng thập niên 80, nhiều nghiên cứu xác nhận sự xuất hiện kháng thểđặc hiệu với protein p53 trong huyết thanh của các bệnh nhân ung thư với nhiều loại ung thư khác nhau. Đa số các bệnh nhân cĩ kháng thể p53 này đều cĩ các đột biến trên p53 làm cho protein p53 được tích lũy trong nhân tế bào, kéo theo sự xuất hiện các đáp ứng miễn dịch giữa kháng thể và p53. Tuy nhiên, chỉ cĩ 30-40% bệnh nhân ung thư cĩ xảy ra sự biến đổi trên p53 cĩ kháng thể này. Các kháng thể này cĩ thể gắn kết đặc hiệu lên vùng đầu amino và đầu cacboxyl của protein p53, là vùng khơng chứa các trình tự các điểm nhạy của đột biến [135].
Đến nay, vẫn cịn nhiều tranh cãi xung quanh việc xác định giá trị lâm sàng của các kháng thể này. Tuy nhiên, với các thử nghiệm xác định biểu hiện của kháng thể trong trị liệu, các nghiên cứu đều nhận thấy cĩ sự mất đi và giảm lượng kháng thể này một cách đáng kể sau khi cĩ điều trị. Vì vậy, kháng thể p53 được xem là cơng cụ xác định hữu hiệu các đáp ứng của liệu pháp điều trị và nhân tố cho thấy sự tái phát sớm các ung thư [135].
Sự xuất hiện của các kháng thể p53 này trong huyết thanh là dấu hiệu đầu tiên cho phép liên tưởng đến các đột biến p53 xảy ra trong quá trình hình thành khối u, vì thế phương pháp này thường được dùng để nhận diện sớm các ung thư. Tuy nhiên, các kháng thể p53 này chỉ thường xuất hiện nhiều trong các cá thể cĩ nguy cơ cao như bệnh nhân ung thư phổi và cĩ dùng nhiều thuốc lá. Vì thế, độ nhạy của phương pháp phân tích huyết thanh nĩi chung cho tất cả các loại ung thưđược xem là cịn thấp [124], [135], [144].
1.2.4.4. Phân tích hĩa mơ miễn dịch
Phương pháp hĩa mơ miễn dịch xác định định tính protêin p53 tích tụ trong nhân tế bào, là hậu quả của đột biến gen gây ra. Nghiên cứu của tác giả Lunn [92] và cộng sự cho thấy, độ nhạy của phương pháp hĩa mơ miễn dịch cao hơn các phương pháp khác như PCR-SSCP, giải trình tự gen trong việc phát hiện đột biến p53 trên CTBG. Hiện nay, nhuộm hĩa mơ miễn dịch là phương pháp phổ biến để nhận diện các tế bào bất thường dựa vào sự biểu hiện vượt mức protein p53. Nguyên tắc chủ yếu của phương pháp này là dựa trên tính gắn kết đặc hiệu giữa các epitop của protein p53 và các paratop của các kháng thể p53 cĩ đánh dấu chất bắt màu. Trong tế bào bất thường, protein p53 thường tập trung biểu hiện ở trong nhân tế bào, vì thế khi nhuộm hĩa mơ miễn dịch thì nhân tế bào sẽ bắt màu, trong khi ở các tế bào bình thường, lượng protein p53 biểu hiện ít nên khơng cho thấy sự bắt màu đặc trưng. Như vậy các tế bào bắt màu với màu nhuộm trong các phân tích hĩa mơ miễn dịch là các tế bào bất thường phải cĩ các đặc điểm: (1) cĩ sự biểu hiện vượt mức protein p53; (2) protein p53 biểu hiện phải được tích lũy trong nhân tế bào; (3) khơng cĩ đột biến và khơng cĩ sự biến đổi cấu trúc khơng gian protein tại vị trí epitop gắn đặc hiệu trên p53 [135].
Vì cĩ đến 80% các đột biến nhầm nghĩa tạo ra các protein p53 đột biến được tích lũy trong nhân nên phương pháp này được xem là phương pháp nhận diện trực tiếp protein đột biến cĩ độ tin cậy cao. Tuy nhiên, các đột biến vơ nghĩa và đột biến dịch khung lại thường khơng tạo ra các protein được tích lũy trong nhân. Vì thế, các kháng thểđánh dấu khơng thể gắn được vào epitop của các protein đột biến [135].
Ngồi ra, phương pháp này sử dụng một số các kháng thể đặc hiệu với p53, nhưng khơng phải tất cả các đột biến đều được nhận diện bởi những kháng thể này [135].
1.2.5. Biểu hiện và ý nghĩa của p53 trên CTBG
Trong những năm gần đây, đột biến gen liên quan đến CTBG, cũng như nhiều loại ung thư khác, được quan tâm nhiều nhất là p53. Các khối u cĩ độ biệt hĩa khác nhau cĩ kiểu đột biến và vị trí đột biến khác nhau. Đột biến p53 ở CTBG cĩ thể xảy ra ở nhiều codon khác nhau, những vị trí đột biến được ghi nhận gồm codon 158, 175, 213, 249, 245. Một số kiểu đột biến đặc trưng cho vùng dịch tễ, tùy thuộc vào các tác nhân đột biến trong mơi trường sống. Điển hình cho cơ chế này là mối liên quan giữa Aflatoxin B1 và CTBG ở Châu Á. Aflatoxin B1 được chứng minh là một đồng tác nhân sinh ung quan trọng trong ung thư gan, thường liên quan đến sự đột biến gen p53.
Trong một nghiên cứu trên các bệnh nhân CTBG ở Địa Trung Hải, tất cả các trường hợp CTBG loại sợi mảnh và CTBG khơng xảy ra trên nền xơ gan hay xơ gan do rượu đều khơng cĩ đột biến p53. Đột biến gen p53 chủ yếu xảy ra trên bệnh nhân CTBG xảy ra trên nền xơ gan liên quan đến tình trạng viêm gan siêu vi. Một số ít các CTBG loại sarcơm cĩ đột biến gen p53. Thời gian sống trung bình của các trường hợp CTBG cĩ đột biến p53 là 43 tháng. Qua nghiên cứu này các tác giả cũng chứng minh được p53 cĩ liên quan đến tiên lượng xấu của các bệnh nhân CTBG. Hầu hết các nghiên cứu đều khơng thấy sự biểu hiện của p53 trên mơ gan xung quanh khối u. Theo nghiên cứu của tác giả Caruso MI và cs [20] trên 193 trường hợp CTBG, tỉ lệ dương tính của p53 trên HMMD ở CTBG (Hình 1.14) là 15%. Nồng độ AFP trong máu cao cũng cĩ liên quan đến sự biểu hiện của p53. Tần suất biểu hiện của p53 trên các bệnh nhân CTBG cĩ nhiễm HCV (36%) cao hơn các bệnh nhân khơng nhiễm HCV (13%). Tuổi, giới, tình trạng nhiễm HBV khơng cĩ mối liên quan với biểu hiện của p53 trên CTBG. Các khối u cĩ độ biệt hĩa càng kém càng cĩ tỉ lệ biểu hiện p53 cao. Tuy nhiên theo nghiên cứu của một số tác giả khác, đột biến p53 (đặc biệt ở codon 249) được xem là yếu tố sinh ung kết hợp với HBx (là yếu tố sinh ung được chứng minh cĩ liên quan đến HBV) gây ra CTBG [68], [122].
Những bệnh nhân CTBG cĩ biểu hiện dương tính của p53, Ki-67 cùng với nồng độ AFP cao được thấy cĩ tiên lượng xấu và dự đốn sẽ tái phát sớm. Kích thước u càng lớn tỉ lệ tái phát sớm càng tăng lên [52].
Tác giả Cohen và De Rosa [30] nghiên cứu thấy cĩ khác biệt về biểu hiện p53 trên bệnh nhân CTBG so với các trường hợp nghịch sản tế bào gan. P53 dương tính trong 48% các trường hợp CTBG, trong khi đĩ chỉ cĩ 3% trường hợp nghịch sản tế bào gan. Theo tác giả Lee và cộng sự [81], tốc độ tăng sản tế bào của nghịch sản tế bào gan thấp (Ki-67 và PCNA) nhưng tỉ lệ chết tế bào theo chương trình của các trường hợp nghịch sản tế bào gan loại tế bào lớn (LCD) cao hơn tế bào gan bình thường.
Hình 1.14: Biểu hiện dương tính mạnh của p53 trên CTBG so với mơ gan khơng u
Dựa vào biểu hiện của p53 trên hĩa mơ miễn dịch cĩ thể tiên lượng cho các bệnh nhân CTBG. Hầu hết các nghiên cứu chúng tơi cĩ được đến nay cho thấy cĩ khoảng 22,5%-27% các trường hợp CTBG tìm thấy protein p53 bằng phương pháp hố mơ miễn dịch. Trong một số nghiên cứu khác, các trường hợp cĩ biểu hiện p53 dương tính lên đến 50% các trường hợp. Kích thước u càng lớn tỉ lệ này càng tăng lên. Tỉ lệ biểu hiện của p53 trong huyết thanh của các trường hợp CTBG theo nghiên cứu của tác giả Ryder và cộng sự [4] thực hiện tại Viện nghiên cứu về gan tại Luân đơn cũng lên đến 50%. Tỉ lệ biểu hiện của p53 cũng thay đổi nhiều tùy