Hình 3.36. Phổ ESI-MS của mẫu ly trích từ hạt dịng D2-1
Hình 3.37. Phổ ESI-MS của mẫu ly trích từ hạt dịng D8-1
3.11.2.7. Đánh giá sự sinh trưởng cây chuyển gen T0, T1 trong điều kiện ex vitro
Nhìn chung cây đậu tƣơng chuyển gen T0 trồng trong vƣờn ƣơm đạt kích thƣớc tối đa lúc cây ra hoa, đậu quả, có kiểu hình các bộ phận tƣơng tự với cây đối
chứng cấy mô và nhỏ hơn nhiều so với cây đối chứng trồng từ hạt (hình 3.38, bảng 3.15). Các bộ phận của cây chuyển gen phát triển bình thƣờng, lá xanh, gồm 3 lá mỗi nhánh, hình dạng phiến lá bình thƣờng, thân thẳng, hoa màu tím nhạt, hình dạng cánh hoa nhƣ cây đối chứng. Thời gian từ khi trồng đến lúc quả chín, thu hạt khoảng 4 tháng, giống với cây đối chứng. Ngồi kiểu hình, đặc điểm khác biệt lớn giữa cây chuyển gen, đối chứng cấy mô so với cây đối chứng trồng từ hạt là khả năng sinh sản cây chuyển gen, đối chứng cấy mô thấp hơn nhiều so với cây đối chứng trồng từ hạt. Cây chuyển gen chỉ có khả năng đậu 1-2 quả, mỗi quả từ 1-2 hạt. Điều này gây hạn chế lớn đến khả năng thu nhận thể chuyển gen ở các thế hệ sau. Tuy cây chuyển gen T0 có kiểu hình nhỏ, năng suất hạt thấp nhƣng ở thế hệ T1 trồng từ hạt phát triển bình thƣờng cả về kích thƣớc và năng suất. Hạt chuyển gen có màu đỏ, về kích thƣớc khơng khác nhiều so với hạt đối chứng. Màu đỏ chỉ biểu hiện chuyên biệt ở hạt, các bộ phận khác nhƣ thân, lá, hoa màu sắc không bị thay đổi. Các giai đoạn sinh trƣởng, phát triển, ra hoa, đậu trái bình thƣờng nhƣ đối chứng. Một số nghiên cứu chuyển gen vào đậu tƣơng cũng ghi nhận từ thế hệ T1, cây chuyển gen khơng khác biệt về hình thái và năng suất so với cây đối chứng không chuyển gen [122][194]. Sau đây là bảng so sánh một số thơng số kiểu hình, năng suất của cây chuyển gen T0, T1 và đối chứng cấy mô, trồng từ hạt.
ảng 3 15. So sánh một số đặc điểm của cây chuyển gen và đối chứng.
Cây đậu tƣơng Chiều
cao (cm) Đƣờng kính thân (mm) Số nhánh Số hạt Đƣờng kính (mm) - trọng lƣợng trung bình của hạt (g) ĐC1 11 1,8 5 4 5,5 (0,12) D2 9 1,6 4 2 5,4 (0,11) D8 8,5 1,4 4 2 5,6 (0,13) ĐC2 73 3,5 11 109 6,7 (0,18) D2-1 76 3,2 10 99 6,5 (0,16) D8-1 71 3,4 11 104 6,8 (0,18)
Hình 3.38. So sánh kiểu hình cây chuyển gen và cây đối chứng.
Cây chuyển gen To (a), đối chứng từ hạt (b), chuyển gen T1 (c) sau 6 tuần; cây chuyển gen To (d), đối chứng (e), chuyển gen T1 (f) sau 14 tuần.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Nội dung 1: Xây dựng hệ thống tạo cây con hoàn chỉnh in vitro từ đốt là mầm và một nửa hạt
Hạt đậu tƣơng đƣợc khử trùng bằng khí clo trong 16 giờ giúp tạo mẫu sạch và giữ khả năng nảy mầm của hạt tốt nhất. BA 2 mg/l là nồng độ tối ƣu để cảm ứng tạo chồi từ đốt lá mầm và một nửa hạt của ba giống MTĐ 176; HL 07-15 và OMĐN 29. Ngoài ra, IBA 1 mg/l và 1,5 mg/l lần lƣợt là nồng độ tối ƣu để cảm ứng tạo rễ từ mẫu chồi của hai giống MTĐ 176; HL 07-15 và giống OMĐN 29.
Nội dung 2: Khảo sát các điều kiện thích hợp để ứng dụng trong qui trình chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng
Nồng độ PPT tối ƣu để chọn lọc chồi chuyển gen của giống MTĐ 176, OMĐN 29 và HL 07-15 lần lƣợt là 6, 5 và 5 mg/l. Ngoài ra, bổ sung PPT từ 1 mg/l trong mơi trƣờng ni cấy có thể giúp duy trì áp lực chọn lọc cho chồi chuyển gen. Kim châm nhiều mũi đƣợc sử dụng để đâm nhẹ 3 lần lên vùng đốt lá mầm sẽ tạo vết thƣơng mẫu phù hợp cho các nghiên cứu chuyển gen.
Mẫu đốt lá mầm đƣợc tạo vết thƣơng bằng dao mổ và kết hợp xử lý với sóng siêu âm 30s hoặc thấm hút chân không 60s (-20 in Hg) sẽ giúp tăng đáng kể hiệu quả chuyển gen gus vào đậu tƣơng, từ 1,67% lên 10% (sóng siêu âm) và từ 1,67% lên 8,33% (thấm hút chân không).
Nội dung 3: Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens và kiểm tra, đánh giá các dòng đậu tƣơng chuyển gen.
Phƣơng pháp tạo vết thƣơng vùng đốt lá mầm (giống MTĐ 176) bằng cách sử dụng kim châm đâm nhẹ 3 lần để thay thế dao mổ đã giúp tăng hiệu quả chuyển gen tạo astaxanthin từ 0,33% lên 1%. Ngoài ra, việc kết hợp sử dụng sóng siêu âm 30s hoặc thấm chân khơng 60s (-20 in Hg) trong quá trình tạo vết thƣơng mẫu đốt lá mầm cũng giúp tăng hiệu quả chuyển gen từ 0,67 % lên 2%.
Nghiên cứu đã tạo đƣợc nhiều dòng đậu tƣơng biến đổi gen, trong đó 2 dịng có khả năng tạo hạt và sản xuất astaxanthin chuyên biệt ở hạt. Hàm lƣợng
astaxanthin trong hạt thế hệ T1 của hai dịng đậu tƣơng chuyển gen lần lƣợt là 0,31 µg/g (D2) và 0,77 µg/g (D8). Các dịng đậu tƣơng chuyển gen có khả năng di truyền và biểu hiện gen biến nạp qua nhiều thế hệ. Trong các giai đoạn sinh trƣởng, phát triển cũng nhƣ năng suất hạt cho thấy cây chuyển gen và đối chứng khơng có nhiều khác biệt.
KIẾN NGHỊ
Nghiên cứu đã cho thấy bằng cách sử dụng các phƣơng pháp tạo vết thƣơng mẫu thích hợp nhƣ dùng kim châm đâm nhẹ vùng đốt lá mầm hoặc tạo vết thƣơng có sự kết hợp của sóng siêu âm, thấm hút chân khơng có thể giúp nâng cao đáng kể hiệu quả chuyển gen vào giống MTĐ 176 nên có thể đƣợc áp dụng để tăng hiệu quả chuyển gen vào các giống đậu tƣơng khác.
Phƣơng pháp tạo vết thƣơng bằng kim châm nhiều mũi hoặc tạo vết thƣơng trong qui trình chuyển gen vào đốt lá mầm đã giúp nâng cao đáng kể hiệu quả chuyển gen vào giống đậu tƣơng MTĐ 176 nên có thể đƣợc áp dụng
Các hạt đậu tƣơng màu đỏ đậm cần tiếp tục đƣợc gieo trồng thêm nhiều thế hệ để nhận đƣợc các cây tạo hạt đỏ đậm, khơng phân ly. Sau đó các cây này cần đƣợc đánh giá về khả năng sinh trƣởng, phát triển, năng suất tạo hạt, hàm lƣợng astaxanthin trong hạt nhằm định hƣớng khả năng ứng dụng tạo sản phẩm chứa astaxanthin nguồn gốc tự nhiên.
Việc tăng cƣờng hơn con đƣờng chuyển hóa hƣớng đến sự tạo astaxanthin có thể đƣợc thực hiện thơng qua một số định hƣớng nhƣ chuyển thêm gen mã hóa phytoene desaturase, bất hoạt gen mã hóa enzyme lycopene e-cyclase để hƣớng tiền chất vào nhánh β,β hoặc bất hoạt gen mã hóa enzyme β-ring carotene hydroxylase. Mặc dù, một số nghiên cứu tạo cây bắp và lúa biến đổi gen sản xuất astaxanthin đã biến nạp thành công cấu trúc gồm 5 gen, tuy nhiên việc đƣa thêm các yếu tố mới vào cấu trúc 4 gen hiện tại (bar, Zm-psy, cbfd2, hbfd1) cần đƣợc thực hiện lần lƣợt từng yếu tố nhằm đánh giá ảnh hƣởng đến hiệu quả biến nạp gen cũng nhƣ sự biểu hiện ổn định của các gen này.
DANH MỤC CƠNG TRÌNH
1. Hồng Văn Dƣơng, Phan Tƣờng Lộc, Lê Tấn Đức, Nguyễn Huỳnh Cẩm
Tú, Nguyễn Hữu Hổ, Tăng hiệu quả chuyển gen vào cây đậu nành bằng
phương pháp chuyển gen sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens kết hợp sóng siêu âm, thấm chân khơng, Công Nghệ Sinh Học, 2017, 15 (3A),
185-194.
2. Hoàng Văn Dƣơng, Phan Tƣờng Lộc, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Sử
dụng kim châm trên đốt lá mầm trong chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo astaxanthin ở cây đậu nành, Công nghệ sinh
học, 2017, 15 (4A), 55-62.
3. Hoàng Văn Dƣơng, Phan Tƣờng Lộc, Lê Tấn Đức, Nguyễn Huỳnh Cẩm
Tú, Trần Thị Ngọc Hà, Nguyễn Hữu Hổ, Tạo cây đậu tương chuyển gen có
khả năng sản xuất astaxanthin chuyên biệt ở hạt thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Kỷ yếu Hội Nghị Cơng Nghệ Sinh Học Tồn
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. G. Goswami, S. Chaudhuri, D. Dutta, The present perspective of astaxanthin with
reference to biosynthesis and pharmacological importance, World Journal of
Microbiology and Biotechnology, 2010, 26 (11), 1925-1939.
2. R.G. Fassett, J.S. Coombes, Astaxanthin: a potential therapeutic agent in
cardiovascular disease, Marine drugs, 2011, 9 (3), 447-465.
3. M. Shah, R. Mahfuzur, Y. Liang, J.J. Cheng, M. Daroch, Astaxanthin-producing
green microalga Haematococcus pluvialis: from single cell to high value commercial products, Frontiers in plant science, 2016, 7, 531.
4. A. Molino, J. Rimauro, P. Casella, A. Cerbone, V. Larocca, S. Chianese, D. Karatza, S. Mehariya, A. Ferraro, E. Hristoforou, Extraction of astaxanthin
from microalga Haematococcus pluvialis in red phase by using generally recognized as safe solvents and accelerated extraction, Journal of
biotechnology, 2018, 283, 51-61.
5. J.L. Barredo, C. García-Estrada, K. Kosalkova, C. Barreiro, Biosynthesis of
astaxanthin as a main carotenoid in the heterobasidiomycetous yeast Xanthophyllomyces dendrorhous, Journal of Fungi, 2017, 3 (3), 44.
6. F.X. Cunningham, E. Gantt, Elucidation of the pathway to astaxanthin in the
flowers of Adonis aestivalis, The Plant Cell, 2011, 23 (8), 3055-3069.
7. J.C. Huang, Y.J. Zhong, J. Liu, G. Sandmann, F. Chen, Metabolic engineering of
tomato for high-yield production of astaxanthin, Metabolic engineering, 2013,
17, 59-67.
8. Q. Zhu, D. Zeng, S. Yu, C. Cui, J. Li, H. Li, J. Chen, R. Zhang, X. Zhao, L. Chen, From golden rice to a STARice: bioengineering Astaxanthin
biosynthesis in rice endosperm, Molecular plant, 2018, 11 (12), 1440-1448.
9. J. Alcaíno, M. Baeza, V. Cifuentes, Carotenoid distribution in nature, Carotenoids in Nature, 2016, 3-33.
10. G. Britton, Carotenoid research: History and new perspectives for chemistry in
biological systems, Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell
11. E. Alós, M.J. Rodrigo, L. Zacarias, Manipulation of carotenoid content in plants
to improve human health. Carotenoids in Nature, Springer, 2016, 311-343.
12. D. Gayen, S. Ghosh, S. Paul, S.N. Sarkar, S.K. Datta, K. Datta, Metabolic regulation of carotenoid-enriched golden rice line, Frontiers in plant science,
2016, 7, 1622.
13. X. Zheng, G. Giuliano, S. Al-Babili, Carotenoid biofortification in crop plants:
citius, altius, fortius, Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and
Cell Biology of Lipids, 2020, 1865 (11), 158664.
14. S. Fakhri, F. Abbaszadeh, L. Dargahi, M. Jorjani, Astaxanthin: A mechanistic
review on its biological activities and health benefits, Pharmacological
research, 2018, 136, 1-20.
15. S. Davinelli, M.E. Nielsen, G. Scapagnini, Astaxanthin in skin health, repair,
and disease: A comprehensive review, Nutrients, 2018, 10 (4), 522.
16. B. Capelli, S. Talbott, L. Ding, Astaxanthin sources: Suitability for human
health and nutrition, Functional Foods in Health and Disease, 2019, 9 (6),
430-445.
17. S.H.A. Raza, S.R.Z. Naqvi, S.A. Abdelnour, N. Schreurs, Z.M. Mohammedsaleh, I. Khan, A.F. Shater, M.E. Abd El-Hack, A.F. Khafaga, G. Quan, Beneficial effects and health benefits of Astaxanthin molecules on
animal production: A review, Research in Veterinary Science, 2021, 138, 69-
78.
18. W. Xia, N. Tang, H.K. Varkaneh, T.Y. Low, S.C. Tan, X. Wu, Y. Zhu, The
effects of astaxanthin supplementation on obesity, blood pressure, CRP, glycemic biomarkers, and lipid profile: A meta-analysis of randomized controlled trials, Pharmacological research, 2020, 105113.
19. N. Nisar, L. Li, S. Lu, N.C. Khin, B.J. Pogson, Carotenoid metabolism in
plants, Molecular plant, 2015, 8 (1), 68-82.
20. T. Sun, H. Yuan, H. Cao, M. Yazdani, Y. Tadmor, L. Li, Carotenoid metabolism in plants: the role of plastids, Molecular plant, 2018, 11 (1), 58- 74.
21. R. Baranski, C. Cazzonelli, Carotenoid biosynthesis and regulation in plants. Carotenoids: Nutrition, Analysis and Technology, Wiley-Blackwell Hoboken, 2016, 161-189.
22. F. Cunningham, E. Gantt, Genes and enzymes of carotenoid biosynthesis in
plants, Annual review of plant biology, 1998, 49 (1), 557-583.
23. C.A. Howitt, B.J. Pogson, Carotenoid accumulation and function in seeds and
non‐green tissues, Plant, cell & environment, 2006, 29 (3), 435-445.
24. A.S. Hermanns, X. Zhou, Q. Xu, Y. Tadmor, L. Li, Carotenoid pigment
accumulation in horticultural plants, Horticultural Plant Journal, 2020, 6 (6),
343-360.
25. P.D. Fraser, S. Römer, J.W. Kiano, C.A. Shipton, P.B. Mills, R. Drake, W. Schuch, P.M. Bramley, Elevation of carotenoids in tomato by genetic
manipulation, Journal of the Science of Food and Agriculture, 2001, 81 (9),
822-827.
26. P.D. Fraser, P.M. Bramley, The biosynthesis and nutritional uses of carotenoids, Progress in lipid research, 2004, 43 (3), 228-265.
27. C.K. Shewmaker, J.A. Sheehy, M. Daley, S. Colburn, D.Y. Ke, Seed‐specific
overexpression of phytoene synthase: increase in carotenoids and other metabolic effects, The Plant Journal, 1999, 20 (4), 401-412.
28. J.A. Paine, C.A. Shipton, S. Chaggar, R.M. Howells, M.J. Kennedy, G. Vernon, S.Y. Wright, E. Hinchliffe, J.L. Adams, A.L. Silverstone, Improving the
nutritional value of Golden Rice through increased pro-vitamin A content,
Nature Biotechnology, 2005, 23 (4), 482.
29. G. Diretto, S. Al-Babili, R. Tavazza, V. Papacchioli, P. Beyer, G. Giuliano,
Metabolic engineering of potato carotenoid content through tuber-specific overexpression of a bacterial mini-pathway, PLoS One, 2007, 2 (4), e350.
30. M. Aluru, Y. Xu, R. Guo, Z. Wang, S. Li, W. White, K. Wang, S. Rodermel,
Generation of transgenic maize with enhanced provitamin A content, Journal
of experimental Botany, 2008, 59 (13), 3551-3562.
31. G. Farré, L. Perez-Fons, M. Decourcelle, J. Breitenbach, S. Hem, C. Zhu, T. Capell, P. Christou, P.D. Fraser, G. Sandmann, Metabolic engineering of
astaxanthin biosynthesis in maize endosperm and characterization of a prototype high oil hybrid, Transgenic Research, 2016, 25 (4), 477-489.
32. C. Li, J. Ji, G. Wang, Z. Li, Y. Wang, Y. Fan, Over-Expression of LcPDS,
LcZDS, and LcCRTISO, Genes From Wolfberry for Carotenoid Biosynthesis, Enhanced Carotenoid Accumulation, and Salt Tolerance in Tobacco, Frontiers
in plant science, 2020, 11, 119.
33. R.P. McQuinn, B. Wong, J.J. Giovannoni, AtPDS overexpression in tomato:
exposing unique patterns of carotenoid self‐regulation and an alternative strategy for the enhancement of fruit carotenoid content, Plant biotechnology
journal, 2018, 16 (2), 482-494.
34. Z. Zhao, Z. Liu, X. Mao, Biotechnological Advances in Lycopene β-Cyclases, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2020, 68 (43), 11895-11907. 35. A. Hannoufa, Z. Hossain, Regulation of carotenoid accumulation in plants,
Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 2012, 1 (3), 198-202.
36. M. Hayashi, T. Ishibashi, D. Kuwahara, K. Hirasawa, Commercial Production
of Astaxanthin with Paracoccus carotinifaciens, Carotenoids: Biosynthetic and
Biofunctional Approaches, 2021, 1261, 11-20.
37. K. Bernhard, Synthetic astaxanthin. The route of a carotenoid from research to
commercialisation. Carotenoids, Springer, 1989, 337-363.
38. M. Rodríguez-Sáiz, J.L. de la Fuente, J.L. Barredo, Xanthophyllomyces dendrorhous for the industrial production of astaxanthin, Applied
microbiology and biotechnology, 2010, 88 (3), 645-658.
39. A. Mortensen, L.H. Skibsted, Importance of carotenoid structure in radical-
scavenging reactions, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1997, 45
(8), 2970-2977.
40. R. Ambati, S.-M. Phang, S. Ravi, R. Aswathanarayana, Astaxanthin: sources,
extraction, stability, biological activities and its commercial applications-a review, Marine drugs, 2014, 12 (1), 128-152.
41. L. Ekpe, K. Inaku, V. Ekpe, Antioxidant effects of astaxanthin in various
42. J. Dose, S. Matsugo, H. Yokokawa, Y. Koshida, S. Okazaki, U. Seidel, M. Eggersdorfer, G. Rimbach, T. Esatbeyoglu, Free radical scavenging and
cellular antioxidant properties of astaxanthin, International journal of
molecular sciences, 2016, 17 (1), 103.
43. B. Capelli, S. Talbott, L. Ding, F. Capelli, Efficacy of astaxanthin from different
sources: Reports on the suitability for human health and nutrition, Global
Perspectives on Astaxanthin, 2021, 391-409.
44. G. Hussein, U. Sankawa, H. Goto, K. Matsumoto, H. Watanabe, Astaxanthin, a carotenoid with potential in human health and nutrition, Journal of natural
products, 2006, 69 (3), 443-449.
45. F.J. Pashkow, D.G. Watumull, C.L. Campbell, Astaxanthin: a novel potential
treatment for oxidative stress and inflammation in cardiovascular disease, The
American journal of cardiology, 2008, 101 (10), 58-68.
46. K.C. Lim, F.M. Yusoff, M. Shariff, M.S. Kamarudin, Astaxanthin as feed
supplement in aquatic animals, Reviews in Aquaculture, 2018, 10 (3), 738-
773.
47. M. Ahuja, J. Varavadekar, M. Vora, P. Sethia, H. Reddy, V. Rangaswamy,
Astaxanthin: Current Advances in Metabolic Engineering of the Carotenoid,
High Value Fermentation Products: Human Health, 2019, 1, 381-399.
48. C.V.G. Prieto, F.D. Ramos, V. Estrada, M.A. Villar, M.S. Diaz, Optimization of
an integrated algae-based biorefinery for the production of biodiesel, astaxanthin and PHB, Energy, 2017, 139, 1159-1172.
49. B. Stachowiak, P. Szulc, Astaxanthin for the Food Industry, Molecules, 2021, 26 (9), 2666.
50. S. Jannel, Y. Caro, M. Bermudes, T. Petit, Novel insights into the biotechnological production of Haematococcus pluvialis-derived astaxanthin: Advances and key challenges to allow its industrial use as novel food ingredient, Journal of Marine Science and Engineering, 2020, 8 (10), 789.
51. T. Goodwin, The biochemistry of the carotenoids. II. Animals, Chapmann and Hall, (1984), London.
52. T. Matsuno, Aquatic animal carotenoids, Fisheries science, 2001, 67 (5), 771- 783.
53. S. Boussiba, Carotenogenesis in the green alga Haematococcus pluvialis:
cellular physiology and stress response, Physiologia Plantarum, 2000, 108 (2),
111-117.
54. T. Goodwin, Biosynthesis of carotenoids, Springer, (1980), Netherlands.
55. J. Kim, J.J. Smith, L. Tian, D. DellaPenna, The evolution and function of