2) ứng dụng của chitosan oligosaccharide
2.3 Phương pháp nghiên cứu
• Sơ đồ bố trí thí nghiệmtổng quát
Vi khuẩn
Nuôi cấy vào ống nước muối sinh lý
Bổ sung dịch vi khuẩn vào các dung dịch nước muối sinh lý, chitosan, chitosan phân tử lượng thấp đã chuẩn bị sẵn với các nồng độ nghiên cứu
Để ở điều kiện thường trong thời gian 60 phút, 90 phút, 120 phút
Cấy trên môi trường TSA và ủ trong 24h rồi đọc kết quả
• Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1ml Vi khuẩn 1ml 1ml 60 phút 1ml 90 phút nuôi cấy 120 phút 370C/24h Pha loãng 10-1 10-2 10-3 Nồng độ pha loãng 101 102 103
: ống nghiệm chứa 9ml nước NaCl 0,9% (pH 6,15)
: ống đối chứng, chứa 9ml nước NaCl 0,9% trong acid acetic 0,5% (pH 6,15)
: ống nghiệm chứa 9ml dung dịch chitosan hoặc chitosan phân tử lượng thấp 0,001; 0,025; 0,005; 0,0075; 0,01% trong NaCl 0,9% và acid acetic 0,5% (pH 6,15)
• Các bước tiến hành như sau:
- Chuẩn bị dụng cụ:
Các dụng cụ như: Ống nghiệm, đĩa pectri, que cấy, đũa thủy tinh, đầu pipet… rửa sạch, để ráo và được bao gói kín bằng giấy báo sau đó sấy vô trùng ở 180oC/30 phút.
Riêng đầu pipet được xếp vào các hộp nhựa và được thanh trùng ở 121oC/15 phút.
- Chuẩn bị môi trường:
Môi trường TSA dạng bột được hòa tan trong nước cất với tỉ lệ 40g/l sau đó tiến hành thanh trùng ở 121oC/15 phút trước khi sử dụng.
- Chuẩn bị dung dịch nước muối sinh lý ( NaCl 0,9%):
Dung dịch nước muối sinh lý được pha từ NaCl tinh khiết trong nước cất
Tiến hành: Cân chính xác 0,9g NaCl tinh thể hòa tan vào 100ml nước cất. Dung dịch này được điều chỉnh về pH 6,15 sau đó được hút vào các ống nghiệm (mỗi ống chứa 9ml) rồi
được thanh trùng ở 121oC /15 phút trước khi dùng.
- Chuẩn bị dung dịch chitosan và dung dịch chitosan phân tử lượng thấp:
Dung dịch chitosan và dung dịch chitosan phân tử lượng thấp được pha ở các nồng
độ 0,001%; 0,0025%; 0,005%; 0,0075%; 0,01% trong dung dịch NaCl 0,9% và acid
acetic 0,5%. Điều chỉnh pH của dung dịch đến pH 6,15 bằng dung dich NaOH 2%. - Chuẩn bị dịch vi khuẩn:
Bốn chủng vi khuẩn nghiên cứu được bảo quản trong các ống thạch nghiêng ở điều kiện thích hợp. Trước khi làm thí nghiệm 24 giờ thực hiện cấy ria vi khuẩn trên môi trường không chọn lọc TSA. Mục đích cấy ria là để chọn được vi khuẩn có sức sống tốt nhằm đảm bảo tính hiệu quả và khách quan.
- Tiến hành nuôi cấy:
Dùng que cấy đốt nóng đỏ trên ngọn lửa đèn cồn để vô trùng, sau đó tiến hành cấy vi khuẩn từ đĩa thạch đã chuẩn bị từ hôm trước sang ống nghiệm chứa 9ml NaCl 0,9% vô trùng (nồng độ pha loãng 101). Lấy 1ml dịch vi khuẩn từ ống nghiệm này bổ sung trực tiếp vào ống chứa 9ml dung dịch NaCl 0,9% để đạt nồng độ pha loãng 102. Tiếp theo lấy 1ml dịch vi khuẩn từ ống này bổ sung vào các ống chứa 9ml dung dịch chitosan, ống chứa 9ml dung dịch chitosan olygosaccharide và ống đối chứng đạt nồng độ pha loãng 103. Sau các khoảng thời gian 60 phút, 90 phút, 120 phút tiến hành nuôi cấy trên môi
trường TSA. Dùng pipetmain lấy 1ml dịch ở các ống nghiệm trên (nồng độ pha loãng
103) cho vào đĩa petri đã sấy vô trùng. Sau đó đổ khoảng 15 - 20ml môi trường đã đun
chảy và để nguội đến 40 – 45oC vào đĩa petri đã cấy mẫu. Xoay nhẹ đĩa petri cùng chiều
và ngược chiều kim đồng hồ (mỗi bên 5 vòng) để dung dịch mẫu trộn đều trong môi
Đánh giá khả năng kháng khuẩn của chitosan bằng cách so sánh lượng vi khuẩn trong mẫu chitosan và lượng vi khuẩn trong mẫu chứa dung dịch NaCl 0,9%. Phần trăm tế bào chết được xác định theo công thức:
% tế bào chết = 100% dc cts dc CFU CFU CFU
Trong đó: CFUdc: là số khuẩn lạc trên mẫu đối chứng.
CFUcts: là số khuẩn lạc trên mẫu chitosan hoặc chitosan phân tử lượng thấp. Số khuẩn lạc trên các mẫu được xác định như sau:
V D A M i i i * Trong đó:
Ai: là số khuẩn lạc trung bình đếm được trên đĩa Di: là nồng độ pha loãng
V : là thể tích cấy (1ml)