3.1. Tối ƣu hóa các điều kiện phân tích
Giới hạn phát hiện, khả năng tách và thời gian phân tích của các chất là những tiêu chí quan trọng trong phƣơng pháp điện di mao quản. Do đó, cần phải khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng trực tiếp đến các thông số này nhƣ: dung dịch đệm điện di (thành phần cấu tử đệm, pH và nồng độ đệm tƣơng ứng, chất hoạt hóa bề mặt…), thế tách, thời gian bơm mẫu, chiều cao bơm mẫu…. Đồng thời cần xác định một số thành phần trong nền mẫu thực làm ảnh hƣởng đến việc tách và xác định các chất phân tích cũng đƣợc khảo sát và tìm biện pháp khắc phục (nếu có ảnh hƣởng).
Việc khảo sát các điều kiện tối ƣu đƣợc tiến hành trên thiết bị điện di CE-C4
D với mao quản có đƣờng kính trong 50µm, chiều dài mao quản 50cm. Mẫu đƣợc bơm vào mao quản bằng phƣơng pháp thủy động lực học theo kiểu xiphong bằng cách nâng đầu mao quản (đầu đặt trong dung dịch mẫu) lên cao 20cm so với đầu mao quản còn lại.
3.1.1. Khảo sát dung dịch đệm điện di
Dung dịch đệm điện di trong phƣơng pháp CE-C4D có vai trị rất quan trọng để việc xác định tính chất và đặc trƣng của các quá trình xảy ra trong mao quản. Dung dịch đệm điện di giúp duy trì, ổn định dịng điện trong mao quản và ảnh hƣởng đến tốc độ điện di của chất phân tích. Ba yếu tố gồm: pH, thành phần và nồng độ của dung dịch đệm điện di đóng vai trị quan trọng nhất trong dung dịch đệm điện di. Với mao quản silica, vùng giá trị pH điện di thƣờng dùng và có thể thay đổi trong khoảng từ 2,0 – 10,0 tùy thuộc vào mỗi loại chất phân tích. Vùng pH > 10,0 hoặc pH < 2,0 thƣờng hạn
chế sử dụng do các chất phân tích trong vùng này thƣờng kém bền, dễ bị thay đổi diện tích làm thay đổi dạng tồn tại hay có thể bị kết tủa trong mao quản.
Các hệ đệm điện di phân tích đồng thời axit benzoic, axit sorbic, axit xitric cần có pH xung quanh khoảng 5,0 – 6,0 nhằm đảm bảo các axit phân li hồn tồn ở dạng anion nhƣng dịng EOF lại khơng q lớn để gây cản trở đến dịng chuyển động ngƣợc chiều của các anion.
Tiến hành khảo sát đồng thời thành phần và pH đối với 3 hệ đệm arginin/acetic (Arg/Ace), histidin/acetic (His/Ace) và tris/acetic (Tris/Ace) tại các giá trị pH 4,5; 5,0; 5,5 và 6,0. Giá trị pH đƣợc điều chỉnh trên cơ sở giữ nguyên hợp phần bazơ Arg, His và Tris với nồng độ 10mM và thêm dần hợp phần axit Ace vào cho đến khi đạt giá trị pH muốn khảo sát.
Hỗn hợp chuẩn tƣơng ứng: benzoic 2.10-4
M, xitric 2.10-4M, sorbic 2.10-4M. Thế điện di -20kV, chiều cao bơm mẫu 20cm, thời gian bơm mẫu 30s. Kết quả thu đƣợc thể hiện trong các hình 3.1, hình 3.2 và hình 3.3
Hình 3.1. Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng pH của thành phần dung dịch đệm (His/Ace)
Hình 3.2. Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng pH của thành phần dung dịch đệm (Arg/Ace)
1-xitric 2.10-4M, 2-benzoic 2.10-4M, 3-sorbic 2.10-4M
Hình 3.3. Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng pH của thành phần dung dịch đệm (Tris/Ace)
Kết quả khảo sát cho thấy đối với cả 3 hệ đệm Arg/Ace, His/Ace, Tris/Ace cho điện di đồ có đƣờng nền xấu, thậm chí khơng xuất hiện pic của axit benzoic và axit sorbic ở pH 4,5 và 6,0. Đối với hệ đệm Tris/Ace tại pH 5,5 xuất hiện cả 3 chất phân tích. Tại pH 5,0 cả 2 hệ đệm Arg/Ace và His/Ace xuất hiện cả 3 chất phân tích với thời gian di chuyển sớm, pic gọn và sắc nét. Do đó tại các pH này đƣợc coi là tối ƣu với từng hệ đệm và đƣợc lựa chọn để so sánh với nhau.
Kết quả so sánh 3 pH của 3 hệ đệm đƣợc thể hiện trong hình 3.4 và bảng 3.1.
Hình 3.4. Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của thành phần dung dịch đệm
1-xitric 2.10-4M, 2-benzoic 2.10-4M, 3-sorbic 2.10-4M
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng pH của thành phần dung dịch đệm đến diện tích pic (Spic) và thời gian di chuyển (tdc) của xitric, benzoic và sorbic
Hệ đệm (10mV)
Diện tích pic (mV.s) và thời gian di chuyển (s) pH
Xitric Benzoic Sorbic
Spic tdc Spic tdc Spic tdc
Arg/Ace 5,0 93,213 242 155,616 439 310,464 722 His/Ace 5,0 117,322 254 93,326 458 259,021 769 Tris/Ace 5,5 183,688 290 256,727 832 694,600 1618
*dấu “-” thể hiện đây là pic ngƣợc (pic quay xuống dƣới trong khi pic của các anion khác quay lên).
Biểu đồ thể hiện diện tích pic và thời gian di chuyển của các chất phân tích đƣợc thể hiện ở hình 3.5 và 3.6.
Hình 3.5. Biểu đồ diện tích pic của các chất phân tích khi thay đổi hệ đệm
Hình 3.6. Biểu đồ thời gian di chuyển của các chất phân tích khi thay đổi hệ đệm
Trong 3 hệ đệm nghiên cứu chỉ có 2 hệ đệm Arg/Ace và His/Ace (pH 5,0) đều cho khả năng tách tốt các chất phân tích với thời gian và diện tích pic khơng thay đổi
0 100,000 200,000 300,000 400,000 500,000 600,000 700,000 800,000
Spic-xitric Spic-benzoic Spic-sorbic
Arg/Ace pH 5.0 His/Ace pH 5.0 Tris/Ace pH 5.5
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
tdc-xitric tdc-benzoic tdc-sorbic
nhiều. Tuy nhiên điện di đồ ứng với hệ đệm Arg/Ace (pH 5,0) cho kết quả diện tích pic của các chất và thời gian phân tích tốt nhất. Do đó hệ đệm Arg/Ace (pH 5,0) đƣợc lựa chọn để tiếp tục cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt
Trong phƣơng pháp điện di sử dụng mao quản silica, dòng điện di thẩm thấu (EOF) ảnh hƣởng rất nhiều đến q trình phân tích, đặc biệt khi phân tích các anion ở pH cao. Trong nghiên cứu này, dù khơng thực hiện phân tích điện di ở pH cao nhƣng dịng EOF cũng có ảnh hƣởng nhất định khi di chuyển ngƣợc chiều với các ion chất phân tích, làm cho thời gian di chuyển của chúng dài và giãn rộng pic. Để khắc phục điều này, chất hoạt động bề mặt dạng cation CTAB đƣợc thêm vào dung dịch đệm làm thay đổi dòng EOF, rút ngắn thời gian phân tích và làm cho các pic sắc nét hơn. Qua tham khảo tài liệu [10] và khảo sát sơ bộ CTAB ở nồng độ CTAB 30μM cho hiệu quả tốt nhất với hệ đệm Arg/Ace. Kết quả phân tách các chất phân tích bằng phƣơng pháp CE-C4D khi có sử dụng chất hoạt hóa bề mặt CTAB 30μM thể hiện trong hình 3.7.
Hình 3.7. Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt hóa bề mặt CTAB
1-xitric 2.10-4M, 2-benzoic 2.10-4M, 3-sorbic 2.10-4M
Nhƣ vậy, có thể thấy khi thêm CTAB 30μM vào dung dịch đệm điện di thì thời gian phân tích giảm rõ rệt, tín hiệu pic tăng lên và sắc nét hơn rất nhiều. Vì vậy, nồng
độ CTAB 30μM đƣợc lựa chọn để thêm vào dung dịch đệm điện di, làm tăng hiệu quả phân tích và đƣợc sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm
Trong phƣơng pháp điện di mảo quản nồng độ đệm phải đủ lớn để tạo nên môi trƣờng điện li cho các ion di chuyển và không tạo ra các vùng dẫn điện khác nhau trong mao quản làm ảnh hƣởng đến quá trình di chuyển này. Trong nghiên cứu này, để khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ đệm đến quá trình điện di, nồng độ Arg đã đƣợc khảo sát với 3 mức là 7mM; 10mM và 15mM. Các điều kiện khảo sát nhƣ sau:
Hỗn hợp chuẩn tƣơng ứng: benzoic 2.10-4
M, xitric 2.10-4M và sorbic 2.10-4M.
Thế điện di -20kV, chiều cao bơm mẫu 20cm, thời gian bơm mẫu 30s, Arg/Ace + CTAB 30µM, pH=5,0.
Kết quả thu đƣợc thể hiện trong hình 3.8 và bảng 3.2.
Hình 3.8. Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch đệm arginin
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của diện tích pic (Spic) vào nồng độ đệm Arg
C (Arg)
Diện tích pic (mV.s) và thời gian di chuyển (s)
Xitric Benzoic Sorbic
Spic tdc Spic tdc Spic tdc
7mM 61,215 223 111,996 352 182,714 507
10mM 57,300 194 92,628 285 158,909 387
15mM 30,454 210 65,395 318 97,501 408
Dấu “-” thể hiện đây là pic ngƣợc (pic quay xuống dƣới trong khi pic của các anion khác quay lên)
Biểu đồ thể hiện diện tích pic và thời gian di chuyển của các chất phân tích đƣợc thể hiện ở hình 3.9 và 3.10.
Hình 3.9: Biểu đồ diện tích pic các chất phân tích theo nồng độ đệm Arg/Ace
0 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 120,000 140,000 160,000 180,000 200,000
Spic-xitric Spic-benzoic Spic-sorbic
Hình 3.10: Biểu đồ thời gian di chuyển các chất phân tích theo nồng độ đệm Arg/Ace
Khảo sát nồng độ Arg tại 3 giá trị, càng tăng nồng độ đệm thì độ điện di hiệu dụng của chất phân tích tăng. Trong ống mao quản, khi nồng độ đệm tăng, nghĩa là nồng độ của các ion tăng, thƣờng làm thay đổi độ lớn của lớp điện kép, ảnh hƣởng đến sự tƣơng tác tĩnh điện Culong của chất tan với thành mao quản. Lớp điện kép này thƣờng làm cho vùng mẫu di chuyển khơng phẳng do đó tạo ra sự dỗng chân pic, ảnh hƣớng tới thời gian di chuyển nhƣ kết quả với nồng độ Arg 15mM. Ở nồng độ đệm 7mM, lực ion thấp, giảm cƣờng độ dòng điện I dẫn đến thời gian phân tích dài, pic khơng gọn. Cịn ở nồng độ 10mM thời gian di chuyển tốt, pic gọn và sắc nét. Vì vậy nồng độ Arg 10mM đƣợc lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của thế tách
Tiếp tục nghiên cứu ảnh hƣởng của điện thế tách đến sự phân tách pic của các chất phân tích vào điện thế áp vào hai đầu mao quản. Vẫn giữ các điều kiện tối ƣu bao gồm mao quản tổng chiều dài 50cm, chiều dài hiệu dụng 35cm, đƣờng kính trong 50µm, thời gian bơm mẫu vào mao quản 30s, dung dịch đệm Arg(10mM)/Ace pH = 5,0 + CTAB 30µM trong khi điện thế tách đƣợc thay đổi từ -15kV,-17kV và -20kV.
0 100 200 300 400 500 600
tdc-xitric tdc-benzoic tdc-sorbic
Tƣơng tự các thí nghiệm trƣớc, trong thí nghiệm này nồng độ các chất phân tích vẫn đƣợc giữ cố định benzoic 2.10-4M, xitric 2.10-4M và sorbic 2.10-4M.
Kết quả khảo sát đƣợc thể hiện trong hình 3.11 và bảng 3.3.
Thời gian di chuyển (s)
Hình 3.11. Điện di đồ khảo sát sự ảnh hưởng của điện thế tách
1-xitric 2.10-4M, 2-benzoic 2.10-4M, 3-sorbic 2.10-4M
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của điện thế tách đến diện tích pic (Spic) và thời gian di chuyển (tdc) của xitric, benzoic và sorbic.
Thế tách (kV)
Diện tích pic (mV.s) và thời gian di chuyển (s)
Xitric Benzoic Sorbic
Spic tdc Spic tdc Spic tdc
-15kV 45,442 279 98,583 403 158,642 498
-17kV 40,000 242 85,163 350 137,575 432
-20kV 33,644 200 69,963 287 110,734 354
Biểu đồ thể hiện diện tích pic và thời gian di chuyển của các chất phân tích đƣợc thể hiện ở hình 3.12 và hình 3.13.
Hình 3.12: Biểu đồ diện tích pic chất phân tích theo thế tách (kV)
Hình 3.13: Biểu đồ diện tích pic chất phân tích theo thế tách (kV)
Kết quả cho thấy điện thế áp vào hai đầu mao quản càng lớn thì thời gian chất phân tích càng ngắn, diện tích pic giảm. Tuy nhiên khi điện thế áp vào hai đầu mao quản nhỏ nhƣ trong trƣờng hợp -15kV và -17kV thì thời gian phân tích dài dẫn đến gây tốn thời gian khơng cần thiết và có thể làm giãn rộng chân pic. Nhƣ vậy, điện thế tách - 15kV và -17kV làm giảm độ phân giải và tốn thời gian khơng cần thiết. Do đó thế tách đƣợc lựa chọn trong nghiên cứu này là -20kV để đảm bảo cho các nghiên cứu tiếp theo.
0 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 120,000 140,000 160,000 180,000
Spic-xitric Spic-benzoic Spic-sorbic
-15kV -17kV -20kV 0 100 200 300 400 500 600
tdc-xitric tdc-benzoic tdc-sorbic
3.1.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu và chiều cao bơm mẫu
Trong quá trình nạp mẫu vào mao quản, lƣợng mẫu hay vùng mẫu nạp phải đủ lớn để đảm bảo đạt đƣợc độ nhạy tốt nhƣng nếu vùng mẫu nạp vào quá lớn thì sự phân tán (mở rộng vùng mẫu) sẽ xuất hiện do hiện tƣợng khuếch tán làm giảm hiệu suất tách. Do đó, thời gian bơm mẫu và chiều cao bơm mẫu hợp lý cũng cần đƣợc khảo sát để đảm bảo thu đƣợc tín hiệu lớn nhất mà pic không bị giãn rộng. Việc khảo sát thời gian bơm mẫu và chiều cao bơm mẫu đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp thủy động lực học kiểu xiphông với thời gian bơm mẫu từ 20s đến 40s và chiều cao bơm mẫu từ 15cm đến 25cm. Các điều kiện khảo sát nhƣ sau:
Hỗn hợp chuẩn tƣơng ứng: benzoic 2.10-4
M, xitric 2.10-4M, sorbic 2.10-4M. Thế điện di -20kV,dung dịch đệm Arg(10mM)/Ace, pH=5,0 + CTAB 30µM. Kết quả đƣợc thể hiện trong hình 3.14 và hình 3.15.
Hình 3.14. Điện di đồ khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu
Hình 3.15. Điện di đồ khảo sát sự ảnh hưởng của chiều cao bơm mẫu
1-xitric 2.10-4M, 2-benzoic 2.10-4M, 3-sorbic 2.10-4M
Kết quả cho thấy khi tăng thời gian bơm mẫu và chiều cao bơm mẫu thì thời gian di chuyển của các chất thay đổi khơng nhiều nhƣng diện tích các pic tăng tƣơng ứng với thời gian và chiều cao bơm mẫu. Điều này hồn tồn phù hợp vì khi tăng thời gian và chiều cao bơm mẫu sẽ làm tăng lƣợng mẫu đƣợc bơm vào mao quản tạo tín hiệu lớn hơn. Tuy nhiên trong quá trình phân tích mẫu thực cịn có các anion gây ảnh hƣởng đến diện tích pic, nếu thời gian và chiều cao bơm mẫu tăng sẽ tạo các tín hiệu lớn của các anion ảnh hƣởng.
Do đó thời gian bơm mẫu 30s và chiều cao bơm mẫu 20cm đƣợc lựa chọn là điều kiện tối ƣu trong nghiên cứu này để thực hiện các khảo sát tiếp theo.
Từ các kết quả khảo sát thu đƣợc, các điều kiện thích hợp nhằm xác định đồng thời axit benzoic, axit sorbic và axit xitric bằng phƣơng pháp CE-C4D đƣợc tóm tắt trong bảng 3.4
Bảng 3.4. Điều kiện thích hợp xác định đồng thời axit xitric, axit sorbic và axit benzoic bằng phương pháp CE-C4D
Các yếu tố Điều kiện
Detector C4D
Mao quản Mao quản silica, tổng chiều dài 50cm, chiều dài hiệu dụng 35cm, đƣờng kính trong 50µm
Phƣơng pháp bơm mẫu Thủy động lực học kiểu xiphong: 20cm
Thời gian bơm mẫu 30s
Dung dịch đệm điện di Arg(10mM)/Ace, pH = 5,0
Thế tách -20kV
3.1.6. Khảo sát 1 số chất ảnh hưởng trong q trình phân tích mẫu thực tế
Các mẫu thực phẩm đƣợc lựa chọn có thành phần khá phức tạp. Sự có mặt của một số chất nhƣ focmic, propionic, butyric hay clorua trong nền mẫu thật cũng ảnh hƣởng đến q trình phân tích các chất bảo quản. Ảnh hƣởng của các chất trên có thể có trong mẫu đến chất phân tích đƣợc khảo sát bằng cách thêm chuẩn của từng anion với nồng độ thích hợp vào nền chất chuẩn chứa xitric, benzoic và sorbic với các điều kiện tối ƣu đã trình bày ở bảng 3.4. Kết quả khảo sát đƣợc thể hiện trong hình 3.16.
Kết quả cho thấy clorua ảnh hƣởng đến xitric khi nồng độ lớn hơn 10-2M, formic sẽ ảnh hƣởng đến xitric ở nồng độ 10-2M, propionic và butyric ảnh hƣởng đến benzoic và sorbic ở nồng độ 5.10-4M. Do đó trong trƣờng hợp các mẫu phân tích có hàm lƣợng các chất ảnh hƣởng lớn thì cần pha lỗng để đảm bảo q trình phân tích chính xác. Tuy nhiên, khảo sát thực tế đối với các nền mẫu lựa chọn cho thấy chỉ có clorua có ảnh hƣởng đến chất phân tích trong một số mẫu nƣớc và hoa quả ngâm muối nhƣ omai, chanh muối, những chất cịn lại có nồng độ nhỏ hơn ngƣỡng ảnh hƣởng.