0 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 120,000 140,000 160,000 180,000 200,000
Spic-xitric Spic-benzoic Spic-sorbic
Hình 3.10: Biểu đồ thời gian di chuyển các chất phân tích theo nồng độ đệm Arg/Ace
Khảo sát nồng độ Arg tại 3 giá trị, càng tăng nồng độ đệm thì độ điện di hiệu dụng của chất phân tích tăng. Trong ống mao quản, khi nồng độ đệm tăng, nghĩa là nồng độ của các ion tăng, thƣờng làm thay đổi độ lớn của lớp điện kép, ảnh hƣởng đến sự tƣơng tác tĩnh điện Culong của chất tan với thành mao quản. Lớp điện kép này thƣờng làm cho vùng mẫu di chuyển khơng phẳng do đó tạo ra sự dỗng chân pic, ảnh hƣớng tới thời gian di chuyển nhƣ kết quả với nồng độ Arg 15mM. Ở nồng độ đệm 7mM, lực ion thấp, giảm cƣờng độ dòng điện I dẫn đến thời gian phân tích dài, pic khơng gọn. Cịn ở nồng độ 10mM thời gian di chuyển tốt, pic gọn và sắc nét. Vì vậy nồng độ Arg 10mM đƣợc lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của thế tách
Tiếp tục nghiên cứu ảnh hƣởng của điện thế tách đến sự phân tách pic của các chất phân tích vào điện thế áp vào hai đầu mao quản. Vẫn giữ các điều kiện tối ƣu bao gồm mao quản tổng chiều dài 50cm, chiều dài hiệu dụng 35cm, đƣờng kính trong 50µm, thời gian bơm mẫu vào mao quản 30s, dung dịch đệm Arg(10mM)/Ace pH = 5,0 + CTAB 30µM trong khi điện thế tách đƣợc thay đổi từ -15kV,-17kV và -20kV.
0 100 200 300 400 500 600
tdc-xitric tdc-benzoic tdc-sorbic
Tƣơng tự các thí nghiệm trƣớc, trong thí nghiệm này nồng độ các chất phân tích vẫn đƣợc giữ cố định benzoic 2.10-4M, xitric 2.10-4M và sorbic 2.10-4M.
Kết quả khảo sát đƣợc thể hiện trong hình 3.11 và bảng 3.3.
Thời gian di chuyển (s)
Hình 3.11. Điện di đồ khảo sát sự ảnh hưởng của điện thế tách
1-xitric 2.10-4M, 2-benzoic 2.10-4M, 3-sorbic 2.10-4M
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của điện thế tách đến diện tích pic (Spic) và thời gian di chuyển (tdc) của xitric, benzoic và sorbic.
Thế tách (kV)
Diện tích pic (mV.s) và thời gian di chuyển (s)
Xitric Benzoic Sorbic
Spic tdc Spic tdc Spic tdc
-15kV 45,442 279 98,583 403 158,642 498
-17kV 40,000 242 85,163 350 137,575 432
-20kV 33,644 200 69,963 287 110,734 354
Biểu đồ thể hiện diện tích pic và thời gian di chuyển của các chất phân tích đƣợc thể hiện ở hình 3.12 và hình 3.13.
Hình 3.12: Biểu đồ diện tích pic chất phân tích theo thế tách (kV)
Hình 3.13: Biểu đồ diện tích pic chất phân tích theo thế tách (kV)
Kết quả cho thấy điện thế áp vào hai đầu mao quản càng lớn thì thời gian chất phân tích càng ngắn, diện tích pic giảm. Tuy nhiên khi điện thế áp vào hai đầu mao quản nhỏ nhƣ trong trƣờng hợp -15kV và -17kV thì thời gian phân tích dài dẫn đến gây tốn thời gian khơng cần thiết và có thể làm giãn rộng chân pic. Nhƣ vậy, điện thế tách - 15kV và -17kV làm giảm độ phân giải và tốn thời gian khơng cần thiết. Do đó thế tách đƣợc lựa chọn trong nghiên cứu này là -20kV để đảm bảo cho các nghiên cứu tiếp theo.
0 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 120,000 140,000 160,000 180,000
Spic-xitric Spic-benzoic Spic-sorbic
-15kV -17kV -20kV 0 100 200 300 400 500 600
tdc-xitric tdc-benzoic tdc-sorbic
3.1.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu và chiều cao bơm mẫu
Trong quá trình nạp mẫu vào mao quản, lƣợng mẫu hay vùng mẫu nạp phải đủ lớn để đảm bảo đạt đƣợc độ nhạy tốt nhƣng nếu vùng mẫu nạp vào quá lớn thì sự phân tán (mở rộng vùng mẫu) sẽ xuất hiện do hiện tƣợng khuếch tán làm giảm hiệu suất tách. Do đó, thời gian bơm mẫu và chiều cao bơm mẫu hợp lý cũng cần đƣợc khảo sát để đảm bảo thu đƣợc tín hiệu lớn nhất mà pic không bị giãn rộng. Việc khảo sát thời gian bơm mẫu và chiều cao bơm mẫu đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp thủy động lực học kiểu xiphông với thời gian bơm mẫu từ 20s đến 40s và chiều cao bơm mẫu từ 15cm đến 25cm. Các điều kiện khảo sát nhƣ sau:
Hỗn hợp chuẩn tƣơng ứng: benzoic 2.10-4
M, xitric 2.10-4M, sorbic 2.10-4M. Thế điện di -20kV,dung dịch đệm Arg(10mM)/Ace, pH=5,0 + CTAB 30µM. Kết quả đƣợc thể hiện trong hình 3.14 và hình 3.15.
Hình 3.14. Điện di đồ khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu
Hình 3.15. Điện di đồ khảo sát sự ảnh hưởng của chiều cao bơm mẫu
1-xitric 2.10-4M, 2-benzoic 2.10-4M, 3-sorbic 2.10-4M
Kết quả cho thấy khi tăng thời gian bơm mẫu và chiều cao bơm mẫu thì thời gian di chuyển của các chất thay đổi khơng nhiều nhƣng diện tích các pic tăng tƣơng ứng với thời gian và chiều cao bơm mẫu. Điều này hồn tồn phù hợp vì khi tăng thời gian và chiều cao bơm mẫu sẽ làm tăng lƣợng mẫu đƣợc bơm vào mao quản tạo tín hiệu lớn hơn. Tuy nhiên trong q trình phân tích mẫu thực cịn có các anion gây ảnh hƣởng đến diện tích pic, nếu thời gian và chiều cao bơm mẫu tăng sẽ tạo các tín hiệu lớn của các anion ảnh hƣởng.
Do đó thời gian bơm mẫu 30s và chiều cao bơm mẫu 20cm đƣợc lựa chọn là điều kiện tối ƣu trong nghiên cứu này để thực hiện các khảo sát tiếp theo.
Từ các kết quả khảo sát thu đƣợc, các điều kiện thích hợp nhằm xác định đồng thời axit benzoic, axit sorbic và axit xitric bằng phƣơng pháp CE-C4D đƣợc tóm tắt trong bảng 3.4
Bảng 3.4. Điều kiện thích hợp xác định đồng thời axit xitric, axit sorbic và axit benzoic bằng phương pháp CE-C4D
Các yếu tố Điều kiện
Detector C4D
Mao quản Mao quản silica, tổng chiều dài 50cm, chiều dài hiệu dụng 35cm, đƣờng kính trong 50µm
Phƣơng pháp bơm mẫu Thủy động lực học kiểu xiphong: 20cm
Thời gian bơm mẫu 30s
Dung dịch đệm điện di Arg(10mM)/Ace, pH = 5,0
Thế tách -20kV
3.1.6. Khảo sát 1 số chất ảnh hưởng trong q trình phân tích mẫu thực tế
Các mẫu thực phẩm đƣợc lựa chọn có thành phần khá phức tạp. Sự có mặt của một số chất nhƣ focmic, propionic, butyric hay clorua trong nền mẫu thật cũng ảnh hƣởng đến quá trình phân tích các chất bảo quản. Ảnh hƣởng của các chất trên có thể có trong mẫu đến chất phân tích đƣợc khảo sát bằng cách thêm chuẩn của từng anion với nồng độ thích hợp vào nền chất chuẩn chứa xitric, benzoic và sorbic với các điều kiện tối ƣu đã trình bày ở bảng 3.4. Kết quả khảo sát đƣợc thể hiện trong hình 3.16.
Kết quả cho thấy clorua ảnh hƣởng đến xitric khi nồng độ lớn hơn 10-2M, formic sẽ ảnh hƣởng đến xitric ở nồng độ 10-2M, propionic và butyric ảnh hƣởng đến benzoic và sorbic ở nồng độ 5.10-4M. Do đó trong trƣờng hợp các mẫu phân tích có hàm lƣợng các chất ảnh hƣởng lớn thì cần pha lỗng để đảm bảo q trình phân tích chính xác. Tuy nhiên, khảo sát thực tế đối với các nền mẫu lựa chọn cho thấy chỉ có clorua có ảnh hƣởng đến chất phân tích trong một số mẫu nƣớc và hoa quả ngâm muối nhƣ omai, chanh muối, những chất cịn lại có nồng độ nhỏ hơn ngƣỡng ảnh hƣởng.
3.2. Xây dựng đƣờng chuẩn cho các chất phân tích và đánh giá phƣơng pháp
3.2.1. Xây dựng đường chuẩn
Các dung dịch dùng để xây dựng đƣờng chuẩn đƣợc pha từ dung dịch chuẩn gốc với nồng độ thay đổi của axit xitric từ 6.10-5–4.10-4
M, axit benzoic từ 3.10-5-2.10-4M, axit sorbic từ 3.10-5–2.10-4M. Mỗi dung dịch đƣợc bơm vào hệ điện di 3 lần và tiến hành điện di theo các điều kiện thích hợp ở bảng 3.4. Giá trị diện tích pic trung bình của các lần đo lặp lại (n=3) là số liệu để dựng đƣờng chuẩn sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ. Diện tích pic của các chất thu đƣợc trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ xitric, benzoic, sorbic
STT
Xitric Benzoic Sorbic
Nồng độ (1,0.10-5M) Diện tích (mV.s) Nồng độ (1,0.10-5M) Diện tích (mV.s) Nồng độ (1,0.10-5M) Diện tích (mV.s) 1 6 19.450 3 16,189 3 25,583 2 8 26,094 5 27,017 5 47,591 3 10 32,849 7 38,154 7 70,227 4 20 66,770 9 49,013 9 86,823 5 30 104,029 15 84,258 15 147,850 6 40 135,658 20 109,553 20 194,065
Từ kết quả thu đƣợc, sử dụng phần mềm OriginPro 6.1 dựng đƣờng chuẩn và xử lý thống kê số liệu. Kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.17, hình 3.18 và hình 3.19.
Nồng độ axit xitric (10-5
M)
Hình 3.17. Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ axit xitric
Nồng độ axit benzoic (10-5
Hình 3.18. Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ axit benzoic
Nồng độ axit sorbic (10-5M)
Hình 3.19. Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ axit sorbic
Các kết quả phƣơng trình đƣờng chuẩn, hệ số hồi quy tƣơng ứng với các chất phân tích đƣợc trình bày trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Phương trình đường chuẩn của xitric, benzoic, sorbic
Tên chất Phƣơng trình đƣờng chuẩn (y = a + b.x)
Hệ số tƣơng quan (R) P Axit xitric y = (-1,45083±2,39685) + (3,45223±0,10546)x 0,99976 0,168 Axit benzoic y = (-0,54163±2,04408) + (5,54973±0,17824)x 0,99973 0,503 Axit sorbic y = (-1,68580±4,72286) + (9,86922±0,41185)x 0,99955 0,378
Với các kết quả trên cho thấy hệ số tƣơng quan biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ chất phân tích là khá tốt (R > 0,999). Đồng thời các giá trị P < 0,05 đối với cả 3 chất phân tích chứng tỏ x và y có quan hệ tuyến tính. Khi so sánh a với giá trị 0 thấy Pvalue> 0,05 đối với cả 3 chất phân tích: Với axit xitric Pvalue = 0,168; axit benzoic Pvalue = 0,503; axit sorbic Pvalue = 0,387 chứng tỏ a khác 0 khơng có nghĩa và phƣơng pháp khơng mắc sai số hệ thống, có thể xác định xitric, benzoic và sorbic trong mẫu thực.
3.2.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp
Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp (MDL) và giới hạn định lƣợng (MQL) của phƣơng pháp đƣợc xác định trên nền mẫu nƣớc ngọt cocacola có nền mẫu giống với mẫu thật nhƣng khơng chứa chất phân tích. Quy trình phân tích đƣợc nêu trong mục 2.4.1.Các kết quả thu đƣợc thể hiện trong bảng 3.7.
Bảng 3.7. Giới hạn phát hiện axit xitric, axit benzoic, axit sorbic bằng phương pháp CE-C4D trong mẫu nước ngọt cocacola
Chất C(M) Chiều cao pic (S) Tín hiệu nhiễu
đƣờng nền (N) S/N
Axit xitric 1,0.10-5 0,7039 0,198 3,56
Axit benzoic 5,0.10-6 0,5048 0,166 3,04
Axit sorbic 5,0.10-6 0,7192 0,229 3,14
Nhƣ vậy giới hạn phát hiện của axit xitric, axit benzoic và axit sorbic lần lƣợt là 10-5M; 5,0.10-6M và 5,0.10-6M. Giới hạn định lƣợng tƣơng ứng là 3,3.10-5M; 1,7.10-6M và 1,7.10-6M.
Có thể thấy giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp CE-C4D nhằm xác định xitric, benzoic và sorbic thấp, phù hợp để xác định hàm lƣợng chất bảo quản trong nƣớc giải khát cũng nhƣ các mẫu thực phẩm khác nhau.
3.2.3. Đánh giá độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp
Việc đánh giá độ lặp lại và độ thu hồi của phƣơng pháp đƣợc thực hiện trên nền mẫu nƣớc ngọt cocacola có nền mẫu giống với mẫu thực nhƣng khơng chứa chất phân
tích. Mẫu thử đƣợc chuẩn bị bằng cách thêm chuẩn hỗn hợp chất chuẩn xitric, benzoic, sorbic với 3 mức nồng độ thấp, trung bình và cao vào nền mẫu cocacola và xử lý giống với quy trình xử lý mẫu thực. Kết quả thu đƣợc trình bày ở bảng 3.8.
Bảng 3.8. Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp CE-C4D xác định axit xitric axit benzoic và axit sorbic trong mẫu nước ngọt cocacola
Chất phân tích Mức Nồng độ thêm chuẩn (M) Nồng độ thu hồi (M) RSD (%) (n = 6) Độ thu hồi (%) Độ thu hồi TB (%) Axit xitric 1 1,0.10-4 1,02.10-4 1,20 102 99,7 ± 1,99 2 2,0.10-4 1,97.10-4 1,20 98,3 3 4,0.10-4 3,96.10-4 0,26 98,9 Axit benzoic 1 5,0.10-5 5,08.10-5 1,49 102 98,5 ± 3,31 2 1,0.10-4 9,54.10-5 1,30 95,4 3 2,0.10-4 1,96.10-4 0,60 98,2 Axit sorbic 1 5,0.10-5 5,26.10-5 0,36 105 99,6 ± 5,50 2 1,0.10-4 9,98.10-5 0,55 99,8 3 2,0.10-4 1,88.10-4 0,61 94,0
Các kết quả thu đƣợc ở bảng 3.8 cho thấy độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD) của axit xitric, axit benzoic, axit sorbic nhỏ, dao động từ 0,26 ÷ 1,49 %, độ thu hồi khá cao từ 98,5 ÷ 99,7%. Nhƣ vậy phƣơng pháp có độ chụm và độ đúng tốt.
3.3. Phân tích mẫu thực tế
Áp dụng quy trình thu đƣợc ở trên để phân tích 3 chất bảo quản xitric, benzoic và sorbic trong 19 mẫu thực tế bao gồm nƣớc giải khát của các hãng Cocacola, trà thảo mộc Dr.Thanh, Sting, Revice, Tropica, trà Lipton ice tea, bốn mẫu omai, một mẫu thạch mua tại chợ Hàm Tử Quan, quận Hoàn Kiếm, Hà Nội. Các điện di đồ phân tích từng mẫu bằng phƣơng pháp thêm chuẩn đƣợc nêu trong phụ lục 1.
Kết quả phân tích đƣợc xác định bằng phƣơng pháp thêm chuẩn cho thấy không phát hiện 3 chất bảo quản này trong 2 mẫu nƣớc giải khát Cocacola và trà thảo mộc
Dr.Thanh. Trong các mẫu còn lại đã phát hiện 1, 2 hoặc đồng thời cả 3 chất bảo quản phân tích. Kết quả phân tích hàm lƣợng ba chất bảo quản trong mẫu thực phẩm đƣợc thể hiện qua bảng 3.9 và một số điện di đồ minh họa trong hình 3.20, hình 3.21.
Bảng 3.9. Hàm lượng xitric, benzoic, sorbic xác định được trong mẫu thực
Mẫu phân tích
Xitric Benzoic Sorbic
Spic (mV.s) Hàm lƣợng (ppm) Spic (mV.s) Hàm lƣợng (ppm) Spic (mV.s) Hàm lƣợng (ppm) Sting vị dâu 135,126 1740 ± 17 22,448 168± 2,5 49,901 264 ± 3,7 Revice 107,904 3702 ± 13 94,622 179 ± 1,3 40,576 46 ± 0,8 Nƣớc cam Tropica 221,246 2282 ± 10 - - - - Trà Lipton vị đào 124,462 2936 ± 7 - - - - Nƣớc Fanta 145,723 1506 ± 15 47,552 171 ± 1,7 ND ND Nƣớc Fuzitea 147,494 1154 ± 10 ND ND ND ND Nƣớc Ice 319,592 1682 ± 15 - - ND ND Nƣớc trà xanh 187,855 1207 ± 11 ND ND - - Nƣớc Nutiboot 73,847 1622 ± 16 ND ND ND ND Omai mận 87,799 5820 ± 52 ND ND - - Omai sấu 104,998 2558 ± 21 35,457 831 ± 6 21,297 133 ± 1,7 Omai mơ 45,479 1498 ± 12 ND ND ND ND Omai táo 46,590 35304 ± 282 25,963 982 ± 6,4 ND ND
Omai chanh muối 102,576 3789 ± 294 75,690 986 ± 5,2 ND ND
Omai me xào 28,307 2081 ± 93 60,639 739 ± 4,8 ND ND
Thạch 37,966 1242 ±7 18,894 146 ± 0,3 ND ND
Kẹo Dynamite 71,041 1706 ± 13 ND ND ND ND
Kẹo Oishi 74,275 1922 ± 21 ND ND ND ND
ND: Không phát hiện được với giới hạn phát hiện của axit xitric, benzoic và sorbic lần lượt là 10-5M, 5.10-6M và 5.10-6M. Dấu “ - ”: Khơng phân tích.
Hình 3.20. Điện di đồ phân tích xitric, benzoic, sorbic trong một số mẫu nước ngọt
Hình 3.21. Điện di đồ phân tích xitric, benzoic, sorbic trong một số mẫu rắn
(Điều kiện CE: Dung dịch đệm Arg (10mM)/Ace + CTAB 30µM, pH = 5,0; bơm mẫu kiểu xiphong 20cm, 30s, mao quản 50cm, l/L = 35/50cm, ID = 50µm, U = -20kV)
Kết quả phân tích đƣợc xác định bằng phƣơng pháp thêm chuẩn cho thấy axit xitric có trong tất cả các mẫu phân tích. Hàm lƣợng axit benzoic và axit sorbic đều nằm trong giới hạn cho phép của Bộ Y tế theo thông tƣ 27/2012/TT – BYT đối với mẫu nƣớc ngọt là 600mg/l mẫu thạch, omai là 1000mg/kg và mẫu kẹo là 1500mg/kg. Theo thơng tƣ 27/2012/TT – BYT, khơng có quy định rõ ràng về hàm lƣợng axit xitric đƣợc phép sử dụng trong mẫu nƣớc ngọt, mẫu omai hay mẫu thạch.
3.4. Phân tích đối chứng phƣơng pháp CE – C4D với phƣơng pháp HPLC
Để kiểm chứng các kết quả phân tích bằng phƣơng pháp CE – C4
D, các mẫu phân tích đã đƣợc phân tích đối chứng bằng phƣơng pháp tiêu chuẩn (phƣơng pháp HPLC - PDA). Điều kiện phân tích xitric, benzoic và sorbic bằng phƣơng pháp HPLC đƣợc trình bày trong bảng 3.10. Kết quả phân tích đối chứng đƣợc thể hiện trong bảng