Chƣơng 2 : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU
2.2.6. Phân tích ức chế của Allicin trong q trình tạo phản ứng oxy hóa
BMDMs đƣợc sử lý cùng với Laminarin hoặc galactan trong 60 phút, và tích lũy với zymosan sau khi đã đƣợc ủ với không hoặc cùng với Allicin hoặc C-K trong 60 phút. Sau đó, các tế bào đƣợc ủ với DHE trong 15 phút ở 37 0C trong 5% CO2. Những tế bào này sẽ đƣợc kiểm tra bằng laser-scanning confocal microscopy (LSM 510) để xác định mật độ khác nhau của ROS trong các mẫu đã đƣợc xử lý.
2.2.7. X y ựng hình in vivo g y ệnh nhiễm trùng nặng và choáng nhiễ tr ng trên chuột sử ụng zy osan
2.2.7.1. Gây nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng ở chuột bằng tiêm zymosan: Chuột có độ tuổi từ 8-10 tuần (khoảng 18-22 gram) sẽ đƣợc gây nhiễm
trùng nặng và choáng khuẩn bằng cách tiêm dƣới da bụng với zymosan 2mg/kg. Khả năng sống của chuột đƣợc đánh giá sau 5 tiếng đối với 40 giờ đầu và sau đó là 10 giờ trong 5 ngày [50].
2.2.7.2. Đánh giá hiệu quả chống viêm của A icin sử ụng chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng bằng phân tích khả năng sống xót của chuột: Chuột có độ tuổi từ 8-10 tuần (khoảng 18-22 gram) sẽ đƣợc uống với các
nồng độ khác nhau của Allicin. Sau đó, sẽ tiêm zymosan đối với cả chuột đã đƣợc tiêm và không tiêm với Allicin. Khả năng sống của chuột đƣợc đánh giá sau 5 tiếng đối với 40 giờ đầu và sau đó là 10 giờ trong 5 ngày.
2.2.7.3. Đánh giá hiệu quả ức chế sản xuất cytokine tiền viêm (TNF-α, IL-6) trong huyết thanh của chuột: Chuột đƣợc tiêm với các nồng độ khác nhau của
Allicin (10mg/kg, 20mg/kg, 30mg/kg). Sau đó, cả chuột đƣợc tiêm và không tiêm với Allicin sẽ đƣợc tiêm cùng với zymosan. Tiếp sau, lấy huyết thanh và xác định TNF-α, IL-6 bằng kít ELISA.
2.2.7.4. So sánh hiệu quả kháng viê của chất nghiên cứu và chất đối chứng C- K (Một hợp chất chiết xuất từ sâm Hàn quốc [50] trong điều trị chuột bị nhiễm trùng nặng và chống nhiễm trùng: Chuột có độ tuổi từ 8-10 tuần (khoảng
18-22 gram) đƣợc chia thành các nhóm khác nhau và đƣợc thực hiện gây nhiễm trùng nặng và choáng khuẩn. Chuột sẽ đƣợc uống với các nồng độ khác nhau nhƣ trên của Allicin và C-K (30mg/kg). Sau đó, sẽ đƣợc tiêm với zymosan. Khả năng sống của chuột đƣợc đánh giá sau 5 tiếng đối với 40 giờ đầu và sau đó là 10 giờ trong 5 ngày.
2.2.8. Phân tích thống kê
Đối với phân tích thống kê, các số liệu đƣợc lấy từ các kết quả độc lập, đƣợc thể hiện ý nghĩa bằng ± SD và đƣợc phân tích bằng student’s t-test cùng với điều chỉnh Bonferroni hoặc ANOVA đối với nhiều phép so sánh. Sự khác nhau sẽ đƣợc chỉ ra ý nghĩa bằng P< 0.05.
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 min -500 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 mAU 210nm,4nm (1.00)
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đánh giá khả năng tinh sạch của Allicin 3.1. Đánh giá khả năng tinh sạch của Allicin
1 mg bột tỏi đông khơ sẽ đƣợc hịa tan trong 1ml methanol. Sau đó dịch này đƣợc lọc trƣớc khi qua cột C18 đảo pha để đánh giá khả năng tinh sạch bằng phƣơng pháp HPLC. Kết quả thu đƣợc ở hình 6. Từ kết quả 6A, cho thấy hỗn hợp dịch tỏi ban đầu khi nghiền tỏi tƣơi có rất nhiều pic khác nhau. Tuy nhiên, khi dịch tỏi đã đƣợc xử lý qua phƣơng pháp sản xuất Allicin đã thu đƣợc một pic có bƣớc sóng 372nm (hình 6B). Điều này là tƣơng đƣơng với kết quả đã thu đƣợc so với Allicin chiết từ hình 6A và tinh sạch hơn.
A
B
Hình 6: Sắc ký đồ của ịch tỏi trƣớc và sau khi sản xuất A icin từ ịch tỏi.
200 300 400 500 600 700 nm 0 250 500 750 1000 1250 mAU 10.96/ 1.00 275 244 583 636 200 372 264 655 592
3.2. Quy trình sản xuất A icin từ tỏi tƣơi
Bao gồm các bƣớc sau:
Hình 7: Quy trình sản xuất A icin từ tỏi tƣơi
Sản xuất tinh thể deoxyalliin
Sản xuất Alliin
Bổ sung thêm dịch tỏi tƣơi
Dịch Allicin
Đông khô
Kiểm tra bột thu đƣợc bằng HPLC
3.3. Khả năng sống của tế ào kh ng ị ảnh hửơng ởi A icin
Để khẳng định Allicin có gây độc tố đối với tế bào BMDM hay không, BMDM đƣợc chia đều vào các giếng khác nhau trên đĩa nuôi tế bào 96 giếng với mật độ 1x 105. Các BMDM này đƣợc xử lý với Allicin ở các nồng độ khác nhau nhƣ trên hình. Sau đó, BMDM đƣợc ủ cùng với 10 μl kit đếm tế bào. Kết quả đƣợc chỉ ra ở trên hình 8, tỉ lệ phần trăm của các BMDMs khơng có sự khác biệt giữa BMDMs đƣợc xử lý với các nồng độ khác nhau của Allicin sau 48 giờ. Kết quả này cho thấy Allicin khơng có khả năng gây độc với BMDM.
ĐC 10 20 30 ( μg/ml)
Hình 8: Allicin khơng gây độc đối với tế ào BMDMs
BMDMs được nuôi với mật độ 1×105 tế bào/ giếng. Sau 3-4 ngày, các tế bào này
được xử lý cùng với Allicin ở các nồng độ lần lượt là 10, 20, 30 μg/ml. Các tế bào sống đã được đo bằng kit đếm tế bào. Dữ liệu chỉ ra sự sai số của ba thí nghiệm độc lập.
3.4. Đánh giá khả năng zy osan kích thích tế ào BMDM sinh cytokin
Để xác định việc kích thích q trình sinh các cytokine tiền viêm và kháng viêm của BMDM bằng zymosan, BMDM sau khi đã đƣợc nuôi trong đĩa 48 giếng với mật độ là 1x105 sẽ đƣợc ủ với zymosan (100 µg/ml) ở các thời gian khác nhau nhƣ trên hình 9. Nhƣ vậy, zymosan (100µg/ml) kích thích BMDM, sinh cytokine TNF α, IL 6, IL 12p40, IL-10 tăng dần từ mốc 0h , 4h ,8h , 18h sau đó bắt đầu giảm. Từ kết quả này, chỉ ra rằng thời gian ủ Zymosan để sinh ra Cytokine (pg/ml) nhiều nhất là sau 18 giờ.
Hình 9: Zy osan kích thích tế ào BMDM sản xuất cytokin tiền viê và kháng viêm
BMDMs từ chuột được ủ với zymosan (100µg/ml). Dịch tế bào được ủ với zymosan ở các thời gian khác nhau lần lượt là 0, 4, 8, 18, 48 giờ sẽ được đánh giá đối với quá trình sản xuất cytokine bằng ELISA. Các kết quả được biểu hiện sai số ý nghĩa bởi 5 thí nghiệm độc lập.
3.5. A icin ức chế quá trình sinh cytokin tiền viê trong BMDM đƣợc kích thích ởi zy osan
Vai trò của Allicin trong q trình truyền tín hiệu viêm gây ra bởi zymosan vẫn chƣa đƣợc chứng minh. Để đánh giá hiệu quả Allicin trong quá trình này, BMDM đã đƣợc ủ với các nồng độ khác nhau của Allicin trong 45 phút. Sau đó, BMDM đƣợc ủ tiếp với zymosan sau 18 giờ. Từ hình 10 cho thấy Allicin đã ức chế quá trình sản xuất cytokine tiền viêm IL-6. Từ kết quả trên cho thấy với nồng độ 20 µg/ml thì Allicin cho hiệu quả tốt nhất.
Hình 10: Al icin ức chế quá trình sinh cytokin tiền viê trong BMDM đƣợc kích thích ởi zy osan
BMDMs từ chuột được ủ cùng với Allicin (10,20,30 µg/ml), hoặc đối chứng DC(0,1%DC) trong 45phút trước khi ủ với Zymosan 100 µg/ml. Dịch sau khi tế bào được ủ với zymosan 18h sẽ được đánh giá đối với quá trình sản xuất cytokine bằng ELISA kit. Dịch thu được sau 18h sẽ đánh giá bằng kết quả phân tích ELISA. Các
3.6. Al icin điều hịa q trình sinh cytokin tiền viê th ng qua thụ thể Dectin-1
Thụ thể Dectin-1 tham gia chính trong quá trình nhận dạng miễn dịch ban đầu của nấm thơng qua liên kết glucan. Do đó, Allicin đã đƣợc điều tra xem có khả năng ức chế q trình sản xuất cytokine do zymosan kích thích. Đối với mục đích này, BMDMs đã đƣợc ủ cùng với một số nồng độ tăng dần của laminarin, một chất có khả năng ức chế quá trình hoạt động của thụ thể Dectin - 1 [50], hoặc polysaccharide galactan ở các nồng độ giống nhƣ đã chỉ ra laminarin sau 60 phút. Tiếp theo, các tế bào đƣợc ủ cùng với Allicin (hình 11A), C - K (hình 11B) trƣớc khi ủ với zymosan. Tế bào ủ cùng với Laminarin xuất hiện quá trình sinh ra cytokine ngƣợc lại với tế bào khơng xử lý với Laminarin ở hình 11A. Các cytokine TNF-α, và IL-6 trong BMDMs đã tăng dần theo nồng độ của Laminarin. Trái lại, các tế bào đƣợc xử lý cùng với polysaccharide galactan vẫn cho kết quả giống nhƣ tế bào đƣợc xử lý với Allicin. Giống nhƣ kết quả hình 11A, các kết quả trên hình 11B cũng cho kết quả tƣơng tự (điều này đã đƣợc công bố theo [50]) . Những kết quả này gợi ý rằng thụ thể Dectin-1 có một vai trị cơ bản trong quá trình Allicin và C-K truyền đi quá trình ức chế zymosan kích thích sinh ra cytokine tiền viêm trong BMDMs.
TNF-α IL-6 *** *** *** TNF-α *** *** ** 0 1200 2400 3600 4800 TNF-α 0 2000 4000 6000 8000 IL-6 Laminarin - - - 0.1 0.25 0.5- - - - - - 0.1 0.25 0.5 - - - Glactan - - - - - - 0.1 0.25 0.5 - - - - - - 0.10.250.5 Allicin - - + + + + + + + - - + + + + + + + Zymosan - + + + + + + + + - + + + + + + + + TNF-α IL-6 *** *** *** TNF-α *** *** ** 0 1200 2400 3600 4800 TNF-α 0 2000 4000 6000 8000 IL-6 Laminarin - - - 0.1 0.25 0.5- - - - - - 0.1 0.25 0.5 - - - Glactan - - - - - - 0.1 0.25 0.5 - - - - - - 0.10.250.5 Allicin - - + + + + + + + - - + + + + + + + Zymosan - + + + + + + + + - + + + + + + + + 0 2000 4000 6000 8000 ** *** IL-6 TNF-α ** *** *** Laminarin - - - 0.1 0.25 0.5- - - - - - 0.10.250.5 - - - Glactan - - - - - - 0.10.250.5 - - - - - - 0.1 0.25 0.5 C-K - - + + + + + + + - - + + + + + + + Zymosan - + + + + + + + + - + + + + + + + + 0 1200 2400 3600 4800 0 2000 4000 6000 8000 ** *** IL-6 TNF-α ** *** *** Laminarin - - - 0.1 0.25 0.5- - - - - - 0.10.250.5 - - - Glactan - - - - - - 0.10.250.5 - - - - - - 0.1 0.25 0.5 C-K - - + + + + + + + - - + + + + + + + Zymosan - + + + + + + + + - + + + + + + + + 0 1200 2400 3600 4800 0 1200 2400 3600 4800 A Laminarin - - - 0.1 0.250.5 - - - - - - 0.10.250.5 - - - Galactan - - - - - - 0.10.250.5 - - - - - - 0.10.250.5 Allicin - - + + + + + + + - - + + + + + + + Zymosan - + + + + + + + + - + + + + + + + + B Laminarin - - - 0.1 0.250.5 - - - - - - 0.10.250.5 - - - Galactan - - - - - - 0.10.250.5 - - - - - - 0.10.250.5 C- K - - + + + + + + + - - + + + + + + + Zymosan - + + + + + + + + - + + + + + + + +
Hình 11: Allicin hoặc C-K điều hịa q trình đáp ứng viêm kích thích bằng zymosan thơng qua thụ thể dectin-1.
BMDMs đã được ủ ban đầu cùng với chất đối vận thụ thể Dectin-1 ở các nồng độ laminarin (0,1;0,25;0,5mg/ml), polysacaride galactan (0,1;0,25;0,5mg/ml) hoặc với dung môi đối chứng (0,1%) trong 60 phút trước khi xử lý Alicin (20 µg/ml) ( hình A) hoặc C-K (10µg/ml) (hình B) trong 45 phút. Dịch tế bào lấy được sau khi ủ với zymosan sẽ được đánh giá nồng độ cytokine bằng phương pháp ELISA. Kết quả thí nghiệm chỉ sự sai số trong 5 thí nghiệm độc lập.
M SC SC lam gal SC lam gal
M SC SC lam gal SC lam gal
0 5 15 30 60 120 240 480(min)
3.7. Allicin có khả năng ức chế q trình phospho hóa MAPK (p38 và ERK1/2) trong BMDM đƣợc kích thích ởi zy onsan th ng qua thụ thể D ctin-1. BMDM đƣợc tiền xử lý cùng với Allicin. Sau đó các tế bào sẽ đƣợc xử lý cùng với zymosan. Dịch chiết tế bào thu đƣợc sau khi phá tế bào đƣợc chạy điện di trên gel 12% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) và chuyển lên màng PVDF. Màng này đƣợc ủ cùng với kháng thể thứ nhất phosphor-p38, p38 tổng số. Sau đó, màng sẽ đƣợc ủ cùng với kháng thể thứ hai là kháng kháng thể IgG có mang đi horseradish peroxidase. Liên kết của các kháng thể này sẽ đƣợc phát hiện bằng các chất làm tăng phát quang hóa. Từ hình 12A, cho thấy quá trình phospho hóa đã biểu hiện mạnh nhất sau 30 phút đối với cả p38 và ERK1/2. Do vậy, các tế bào BMDMs sau khi đƣợc tiền xử lý với Laminarin hoặc Galactan trong 60 phút. Sau đó đƣợc ủ với Allicin (20 µg/ml) và C-K (10 µg/ml). Sau đó đƣợc ủ với zymosan trong 30 phút, thu tế bào tiến hành phân tích western blot. Kết quả thu đƣợc trên hình 12B, cho thấy Allicin cũng giống nhƣ C-K đã ức chế q trình phospho hóa p38 và ERK 1/2 thơng qua thụ thể Dectin-1. Zym Zym Allicin C - K A B
Hình 12: Kết quả thực hiện k thuật W st rnt ot
Từ kết quả trên ta thấy Allicin với nồng độ 20 µg/ml có khả năng ức chế q trình phospho hóa MAPK (p38 và ERK1/2) trong BMDM được kích thích bởi zymosan thơng qua thụ thể Dectin-1.
3.8. Al icin điều khiển quá trình sinh ROS do zymosan kích thích thơng qua thụ thể Dectin-1
Zymosan có thể kích thích q trình sản xuất ROS trong đại thực bào [16]. Tuy nhiên, vai trò của Allicin trong quá trình sinh ROS do zymosan kích thích trong BMDM vẫn chƣa r . Để điều tra quá trình này, BMDM đã đƣợc ủ cùng với Laminarin hoặc Galactan trong 60 phút trƣớc khi ủ với Allicin (20µg/ml) hoặc C- K (10µg/ml). Sau đó, các tế bào này đƣợc ủ tiếp với zymosan trong 30 phút. Các tế bào này tiếp tục đƣợc ủ với DHE theo nhƣ phần phƣơng pháp. Nhƣ chỉ ra ở hình 13A, zymosan đã kích thích tạo ra ROS, tuy nhiên q trình sản xuất ROS đã bị ức chế bởi tế bào đƣợc ủ với Alicin nhƣng quá trình này bị đảo ngƣợc đối với tế bào đƣợc ủ với Laminarin. Tuy nhiên, điều này không xảy ra với tế bào đƣợc ủ với galactan. Trên hình 13B, kết quả tƣơng tự hình 13A khi thay Allicin bằng C- K. Những kết quả này chỉ ra rằng Allicin đã điều hịa q trình sinh ROS do zymosan kích thích trong BMDM thơng qua thụ thể Dectin-1.
A B Zym Zym
Hình 13: Al icin hoặc C-K ức chế quá trình sản sinh ROS đƣợc kích thích ởi zy osan th ng qua D ctin-1
BMDMs được ủ với laminarin (0,25mg/ml), galactan (0,5mg/ml), hoặc dung môi đối chứng (0,1%) trong 60 phút trước khi ủ với Alicin (20 µg/ml đối với A) hoặc C-K (10 µg/ml đối với B) trong 45phút. Sau đó tế bào được ủ cùng với zymosan (100 µg/ml)trong 30 phút. Tiếp đó các tế bào được ủ cùng với DHE (chất huỳnh quang). Kết quả chỉ mật độ huỳnh quang của tế bào được xác định bằng kính hiển vi hội tụ lazer. Kết quả thí nghiệm chỉ sự sai số trong 5 thí nghiệm độc lập. Alicin, Al; C-K, Compound-K; Zymosan, Zym; Laminarin, Lam; Galactan,gal
Allicin
Gal+ , Al Lam+ , C-K
C-K
Lam+, Al Gal+
3.9. Allicin bảo vệ chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng gây ra ởi zymosan ởi zymosan
Zymosan kích thích q trình viêm cấp tính và làm hỏng đa cơ quan trong các mơ hình động vật bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng [25,26]. Để đánh giá hiệu quả điều trị của Allicin trong chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng, chuột đã đƣợc chia thành 3 nhóm khác nhau (mỗi nhóm 10 con) đƣợc tiêm với Allicin lần lƣợt là 20mg/kg, 30mg/kg trọng lƣợng cơ thể và nhóm đối chứng khơng đƣợc tiêm Allicin. Sau 24 giờ, các nhóm chuột này sẽ đƣợc tiêm zymosan (2mg/kg trọng lƣợng cơ thể). Khả năng chuột sống xót đƣợc tính sau 5 ngày đƣợc tiêm với zymosan. Trên hình 14 cho thấy chuột sau 5 ngày nếu không nhận đƣợc allicin đã chết 100%. Tuy nhiên, chuột nhận đƣợc Allicin ở các nồng độ khác nhau thì khả năng sống xót đã tăng dần. Ở nồng độ Allicin 30 mg/kg tỉ lệ sống xót khoảng 60% . Từ kết quả này, cho thấy Allicin có thể cải thiện đƣợc q trình điều trị chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm khuẩn tại nồng độ 30mg/kg.
3.10. A icin đã à giảm khả năng sản xuất cytokine trong chuột bị nhiễm