Tên hóa chất Cơng thức Hãng sản xuất Thành phần
Polyvinyl pyrolidone (PVP) (C6H9NO)n Ấn Độ M= 55.000g/mol Sodium dodecylsunfate C12H25SO4Na Ấn Độ M=288g/mol
Bạc Nitrate AgNO3 Trung Quốc 99%
Ethyleneglycol C2H4(OH)2 Trung Quốc 99%
2.1.2. Vải dùng trong nghiên cứu
Vải dùng trong nghiên cứu của đề tài này được cung cấp bởi Tổng công ty may 28 Bộ quốc phịng được minh họa trên hình 2.1.
2.1.3. Vi khuẩn và hóa chất cho thử nghiệm vải kháng khuẩn
Vi khuẩn sử dụng trong việc đánh giá khả năng kháng khuẩn của vải tẩm dung dịch keo bạc nano do phịng thí nghiệm vi sinh – bộ môn vi sinh và sinh học trường Đại học Dược Hà Nội. Hóa chất cho việc thực hiện công đoạn sinh học này bao gồm:
- Môi trường canh thang nuôi cấy vi khuẩn kiểm định: NaCl 0,5% ; Pepton 0,5% ; cao thịt 0,3% ; nước vđ 100ml. Môi trường thạch thường : NaCl 0,5% ; Pepton 0,5% ; cao thịt 0,3% ; thạch 1,6% ; nước vđ 100ml. Môi trường Sabouraud: Pepton 1%; glucose 2%; thạch 1,6 %, nước vừa đủ 100 ml.
- Streptomycin : 20 IU/ml đối với vi khuẩn Gr(-). - Benzathin penicillin: 20 IU/ml đối với vi khuẩn Gr(+).
- Kháng sinh chống nấm itraconazol 400 μg/ml pha trong methanol.
2.1.4. Các máy móc thiết bị, dụng cụ
Để thực hiện các công đoạn chế tạo và đánh giá các sản phẩm chế tạo ra, trong luận văn này chúng tôi sử dụng các thiết bị và dụng cụ như sau:
- Lị vi sóng với cơng suất tối đa 1050W (model Electrolux EMM 2011-Thụy Điển)
- Tủ sấy với nhiệt độ tối đa 250oC (model MEMMERT UNB-400 của Nhật Bản)
- Cân phân tích trọng lượng tối đa 210 gam (model TE214S, Sartorius -
Germany)
- Máy quang phổ tử ngoại khả kiến (UV - Vis) (model V-630 của hãng Jasco
Nhật Bản) và máy quang phổ SHIMAZDU 2450 của Nhật bản - Tủ cấy vô trùng (model MCV711ATS, Sanyo - Japan)
- Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) (model JEM-1010 của hãng JEOL – Japan)
- Kính hiển vi điện tử phát xạ trường (FE - SEM) (model S4800 của hãng
HITACHI Japan)
- Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS (Model 6800 của Shimazdu, Nhật Bản)
- Các dụng cụ để thử nghiệm vi sinh như: Pipet, pipetman, đầu tip vô trùng, gịn thấm, gịn khơng thấm, đĩa Petri, que trải, ống nghiệm
- Ống nghiệm, lọ thủy tinh nhỏ, banh, kẹp, kéo, thước, cốc thủy tinh chịu nhiệt, piet loại 1ml, 5ml, 25ml, giấy cân, giấy bọc, nilon bọc….
2.2. Phương pháp điều chế
Để điều chế dung dịch keo bạc nano chúng tơi tiến hành thí nghiệm với tiền chất là bạc nitrat, chất khử ethyleneglycol và chất bảo vệ là PVP hay SDS nhưng thực hiện việc gia nhiệt theo 2 cách khác nhau: gia nhiệt trực tiếp trên bếp khuấy từ và gia nhiệt bằng lị vi sóng. Sau khi chọn dược chất bảo vệ, chúng tôi tiến hành khảo sát các yếu tố sau để tìm được điều kiện điều chế tốt nhất:
- Khảo sát theo phương pháp gia nhiệt - Khảo sát theo tỉ lệ chất bảo vệ và bạc nitrat - Khảo sát theo thời gian gia nhiệt trong lị vi sóng - Khảo sát theo cơng suất lị vi sóng
Cơng thức chung của cả hai phương pháp điều chế có thể tóm tắt như sau: Lấy 30ml ethyleneglycol vào cốc thủy tinh chịu nhiệt loại 100ml, cân 0,2g chất bảo vệ thêm vào cốc và đưa lên máy khuấy từ khuấy liên tục trong thời gian 1 giờ ở 800C. Thêm tiếp vào cốc 0,04g bạc nitrat và khuấy tiếp trên bếp trong 1 giờ hoặc đưa vào lị vi sóng để gia nhiệt trong thời gian 3 phút ở cơng suất lị 100W
Hình 2.2: Hình ảnh máy khuấy từ và lị vi sóng điều chế dung dịch keo nano Ag
Bảng 2.2: Các thí nghiệm đã làm với chất bảo về PVP ở cơng suất lị 100W STT C2H6O2 PVP(g) AgNO3(g) Tỉ lệ Công suất Thời Gian 1a 30ml 0.2 0.04 1:05 100W 1' 1b 30ml 0.2 0.04 1:05 100W 2' 1c 30ml 0.2 0.04 1:05 100W 3' 1d 30ml 0.2 0.04 1:05 100W 4' 2a 30ml 0.2 0.02 1:10 100W 1' 2b 30ml 0.2 0.02 1:10 100W 2' 2c 30ml 0.2 0.02 1:10 100W 3' 2d 30ml 0.2 0.02 1:10 100W 4' 3a 30ml 0.2 0.013 1:15 100W 1' 3b 30ml 0.2 0.013 1:15 100W 2' 3c 30ml 0.2 0.013 1:15 100W 3' 3d 30ml 0.2 0.013 1:15 100W 4' 4a 30ml 0.2 0.01 1:20 100W 1' 4b 30ml 0.2 0.01 1:20 100W 2' 4c 30ml 0.2 0.01 1:20 100W 3' 4d 30ml 0.2 0.01 1:20 100W 4'
Bảng 2.3: Các thí nghiệm đã làm với chất bảo về PVP ở cơng suất lị 230W
6a 30ml 0.2 0.04 1:05 230W 1' 6b 30ml 0.2 0.04 1:05 230W 2' 6c 30ml 0.2 0.04 1:05 230W 3' 6d 30ml 0.2 0.04 1:05 230W 4' 7a 30ml 0.2 0.02 1:10 230W 1' 7b 30ml 0.2 0.02 1:10 230W 2' 7c 30ml 0.2 0.02 1:10 230W 3' 7d 30ml 0.2 0.02 1:10 230W 4'
2.3. Kỹ thuật thực nghiệm
2.3.1. Phổ tử ngoại – khả kiến (UV-VIS)
Phổ tử ngoại – khả kiến (UV-VIS) của các dung dịch keo bạc nano được ghi trên máy V630 của hãng Jasco Nhật bản tại bộ mơn Hóa vơ cơ và máy UV –vis shimazdu 2450 của Khoa Hóa học Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên - ĐHQGHN
Hình 2.3: Máy quang phổ UV-VIS 2.3.2. Ảnh TEM 2.3.2. Ảnh TEM
Sau khi chụp phổ tử ngoại khả kiến, chúng tôi lựa chọn 2 dung dịch keo bạc nano có bước sóng hấp thụ nhỏ là 408nm và 414nm có độ hấp thụ lớn (là những bước sóng đặc trưng của dung dịch keo bạc nano) để tiến hành chụp ảnh bằng kính hiển vi điện tử truyền qua tại phịng thí nghiệm siêu cấu trúc - Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương nhằm xác định kích thước trung bình và sự phân bố kích thước hạt bạc nano điều chế được
Hình 2.4: Kính hiển vi điện tử truyền qua truyền qua
2.3.3. Phổ hấp thụ nguyên tử AAS
Vải sử dụng trong thí nghiệm của luận văn này được chúng tôi xin từ Tông công ty may 28 Bộ quốc phòng là những loại vải được dùng để may lễ phục và quân phục trong Quân đội. Trước hết, vải được giặt sạch, phơi khô dưới ánh nắng mặt trời và cắt thành những miếng vải nhỏ với kích thước 0,5cm x 0,5cm. Ngâm miếng vải vào dung dịch keo bạc nano điều chế được trong thời gian 2 giờ rồi lấy ra làm khô và giặt lại bằng nước sạch để loại bỏ hết phần keo bạc nano liên kết yếu trên bề mặt vải.
Hình 2.5: Mẫu vải thí nghiệm và vải ngâm trong dung dịch dịch keo bạc nano
Miếng vải đã ngâm tẩm dung dịch keo bạc nano được tiến hành phá mẫu bằng cách ngâm trong 1ml dung dịch HNO30,5M trong thời gian 1 giờ để các hạt bạc nano bám trên bề mặt vải có thể bị hịa tan hồn tồn vào dung dịch.
Dung dịch sau khi phá mẫu được tiến hành chụp phổ hấp thụ nguyên tử theo phương pháp không ngọn lửa để xác định nồng độ Ag (theo mg/l) từ đó tính ra lượng Ag bám trên vải (theo mg/cm2)
Hình 2.6: Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử theo phương pháp không ngọn lửa 2.3.4. Ảnh FE – SEM 2.3.4. Ảnh FE – SEM
Tiếp theo chúng tơi tiến hành chụp ảnh bằng kính hiển vi điện tử qt tại phịng thí nghiệm siêu cấu trúc – Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương. Hình ảnh chụp FE – SEM cho phép ta đánh giá mức độ và cách thức bám dính của hạt keo bạc nano trên bề mặt vải
2.4. Thử hoạt tính sinh học của vải tẩm keo bạc nano
Vải sau khi tẩm keo bạc nano và được khảo sát kỹ lưỡng bằng nhiều phương pháp hóa lý khác nhau được mang đi thử nghiệm hoạt tính sinh học tại phịng thí nghiệm vi sinh khoa Vi sinh và sinh học – Trường Đại học Dược Hà Nội.
Để thực hiện thử nghiệm này trước tiên chúng tôi cắt nhỏ miếng vải thành những mảnh nhỏ kích thước 0,5 x 0,5 cm rồi tiến hành ngâm tẩm trong các dung dịch keo bạc nano trong thời gian 2h. Các dung dịch keo bạc nano được chuẩn bị sẵn gồm dung dịch keo nano 100%, dung dịch keo pha loãng trong ethyleneglycol theo các tỉ lệ 1:1; 1:2; 1:3 và 1:4. Sau khi pha loãng, lấy mỗi dung dịch 1ml để ngâm tẩm vải. Vải ngâm sau 2 giờ được lấy ra làm khô trong tủ sấy ở 800C trong 15 phút rồi mang giặt lại bằng nước sạch để loại bỏ phần keo bạc nano bám dính yếu trên bề mặt vải. Sau khi giặt sạch vải được làm khô lại trong tủ sấy ở 800C trong 15 phút và chia thành các
mẫu. Một số miếng vải sau khi ngâm tẩm bằng dung dịch keo bạc nano 100% như trên được giặt lại 5 lần để kiểm tra khả năng kháng khuẩn bạc nano sau nhiều lần giặt.
Nguyên tắc: Mẫu thử (có chứa hoạt chất thử) được đặt lên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy vi sinh vật kiểm định, hoạt chất từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường thạch sẽ
ức chế sự phát triển của vi sinh vật kiểm định tạo thành vịng vơ khuẩn (vô nấm).
Tiến hành:
- Các miếng vải (giấy lọc) vô trùng và đã được sấy khô được tẩm với 3 lần với dung dịch mẫu thử (kháng sinh chuẩn), sau mỗi lần tẩm các miếng vải (giấy lọc) có chứa mẫu thử (hoặc chuẩn) đều được sấy trên nhiệt độ < 60oC đến khô hết dung môi.
- Chuẩn bị môi trường và cấy vi sinh vật kiểm định: Vi sinh vật kiểm định được cấy vào môi trường canh thang, rồi nuôi cấy cho phát
triển trong tủ ấm 37oC trong thời gian 18-24 giờ đến nồng độ 107 tế bào/ml (kiểm tra bằng pha loãng và dãy dịch chuẩn) (Nấm mốc được nuôi trên môi trường Sabouraud thạch nghiêng ở 28 oC trong 5 ngày, rồi sử dụng dung dịch xà phịng 0,2% vơ trùng lấy đính bào tử với nồng độ 105 bào tử/ml). Môi trường thạch thường (cũng như Sabouraud) vô trùng (tiệt trùng 118oC/30 phút) được làm lạnh về 45-500C và được cấy giống vi sinh vật kiểm định vào với tỷ lệ 2,5 ml/ 100 ml. Lắc tròn để vi sinh vật kiểm định phân tán đều trong môi trường thạch, rồi đổ vào đĩa Petri vô trùng với thể tích 20ml/đĩa và để cho thạch đông lại.
- Đặt mẫu thử và mẫu đối chứng: khoanh vải (giấy lọc) đã được tẩm chất thử (kháng sinh chứng) và xử lý như trên được đặt lên bề mặt môi trường thạch (thạch thường cũng như Sabouraud) chứa vi sinh vật kiểm định theo sơ đồ định sẵn.
- Ủ các đĩa Petri có mẫu thử và mẫu đối chứng được đặt như trên trong tủ ấm ở toC = 37oC đối với vi khuẩn (ở 28-30oC đối với vi nấm) trong 18-24h đối với vi khuẩn (24-72 giờ đối với vi nấm), rồi sau đó lấy ra đọc kết quả, đo đường kính vịng vơ khuẩn (vơ nấm) nếu có ( thước kẹp Panmer độ chính xác 0,02 mm).
- Đánh giá kết quả: Dựa trên đường kính vịng vơ khuẩn (vơ nấm) và được đánh giá theo công thức:
D = n D n i i 1 s = 1 ) ( 1 2 n D n i i D D
: Đường kính trung bình vịng vơ khuẩn (vơ nấm) Di: Đường kính vịng vơ khuẩn (vơ nấm)
s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh n: Số thí nghiệm làm song song (3).
Hình 2.8: Dung dịch keo bạc nano pha chế được và các mẫu vải đã cắt nhỏ được sử dụng để ngâm tẩm dụng để ngâm tẩm
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Điều chế dung dịch keo bạc nano 3.1. Điều chế dung dịch keo bạc nano
3.1.1. Chọn chất bảo vệ
Để chọn chất bảo vệ chúng tôi đã tiến hành 2 thí nghiệm hồn toàn tương tự nhau: Lấy 30ml ethyleneglycol vào 2 cốc thủy tinh chịu nhiệt loại 100ml, cân 0,2g chất bảo vệ PVP hoặc SDS thêm vào mỗi cốc và đưa lên máy khuấy từ khuấy liên tục trong thời gian 1 giờ ở 800C. Thêm tiếp vào cốc 0,04g bạc nitrat và đưa vào lị vi sóng
để gia nhiệt trong thời gian 3 phút ở cơng suất lị 100W.
Kết quả với chất bảo vệ SDS chúng tơi thu được dung dịch có màu xám đen dạng huyền phù. Dung dịch này khi lắng lọc bằng phương pháp quay li tâm thì thấy xuất hiện kết tủa. Trong khi đó với chất bảo vệ là PVP chúng tôi thu được dung dịch có màu vàng đặc trưng của dung dịch keo bạc nano [13].
Hình 3.1: Dung dịch keo bạc nano điều chế được với chất bảo về PVP và SDS chế được với chất bảo về PVP và SDS
Với những kết quả này chúng tôi đã quyết định lựa chọn PVP làm chất bảo vệ cho quá trình điều chế dung dịch keo bạc nano.
Cơ chế chung cho việc hình thành các mầm và phát triển các mầm thành các hạt keo kim loại được mô tả theo như tài liệu tham khảo [32] bao gồm 2 bước chính: (1) các ion kim loại bạc (Ag+) trong dung dịch bị khử bởi chất khử phù hợp từ đó hình thành các ngun tử. Các nguyên tử này đóng vai trò như các mầm và xúc tác cho quá trình khử các ion kim loại còn lại trong dung dịch. Sau khi hình thành, các nguyên tử hợp lại đưa đến hình thành các cụm hạt kim loại Ago và được bảo vệ bởi các polyme PVP.
Hình 3.2: Trình bày sự hình thành các hạt kim loại Ago qua từng giai đoạn. 3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp gia nhiệt 3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp gia nhiệt
Để khảo sát ảnh hưởng của phương pháp gia nhiệt, chúng tơi đã tiến hành 2 thí nghiệm như sau: Lấy 30ml ethyleneglycol vào 2 cốc thủy tinh chịu nhiệt 100ml, cân 0,2g PVP thêm vào mỗi cốc và đưa lên máy khuấy từ khuấy liên tục trong thời gian 1 giờ ở 800C. Sau thời gian 1 giờ thêm tiếp vào mỗi cốc 0,04g bạc nitrat. Cốc 1 được đưa vào lị vi sóng để gia nhiệt trong thời gian 3 phút ở công suất 100W, cốc 2 tiếp tục khuấy trên bếp khuấy từ trong thời gian 1 giờ.
Kết quả quá trình điều chế trên bếp khuấy từ chúng tơi chỉ thu được một dung dịch trong suốt có màu vàng rất nhạt, cịn q trình điều chế có gia nhiệt của lị vi sóng chúng tơi thu được dung dịch trong suốt có màu vàng đặc trưng của dung dịch keo bạc nano [13]. Hình 3.3: Dung dịch keo bạc nano điều chế trên bếp khuấy từ Hình 3.4: Dung dịch keo bạc nano điều chế trong lị vi sóng
Từ kết quả thí nghiệm này chúng tơi đi đến quyết định lựa chọn phương pháp điều chế keo bạc nano với tiền chất là bạc nitrat, chất khử là ethyleneglycol, chất bảo vệ là PVP có gia nhiệt bằng lị vi sóng.
3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của cơng suất lị vi sóng
Để khảo sát ảnh hưởng của cơng suất lị vi sóng, chúng tơi tiến hành một dãy các thí nghiệm khác nhau với tiền chất là bạc nitrat (0,04g hoặc 0,02g), chất khử là ethyleneglycol (30ml), chất bảo vệ là PVP (0,2g) với thời gian gia nhiệt là từ 1 đến 4 phút ở cơng suất lị vi sóng lần lượt là 100W và 230W.
Bảng 3.1: Các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của cơng suất của lị vi sóng
STT C2H6O2(ml) AgNO3(g) PVP(g) Tỉ lệ AgNO3:PVP Thời gian Công suất 1a 30 0.04 0.2 1:5 1 100W 1b 30 0.04 0.2 1:5 2 100W 1c 30 0.04 0.2 1:5 3 100W 1d 30 0.04 0.2 1:5 4 100W 6a 30 0.04 0.2 1:5 1 230W 6b 30 0.04 0.2 1:5 2 230W 6c 30 0.04 0.2 1:5 3 230W 6d 30 0.02 0.2 1:5 4 230W 2a 30 0.02 0.2 1:10 1 100W 2b 30 0.02 0.2 1:10 2 100W 2c 30 0.02 0.2 1:10 3 100W 2d 30 0.02 0.2 1:10 4 100W 7a 30 0.02 0.2 1:10 1 230W 7b 30 0.02 0.2 1:10 2 230W 7c 30 0.02 0.2 1:10 3 230W 7d 30 0.02 0.2 1:10 4 230W \
Kết quả chúng tôi thu được các dung dịch điều chế ở cơng suất lị 100W là dung dịch keo bạc nano có màu vàng đặc trưng, nhưng dung dịch điều chế ở cơng suất lị 230W thì chỉ thu được dạng dung dịch có màu vàng với thời gian gia nhiệt 1 phút hoặc 2 phút còn ở thời gian gia nhiệt 3 phút hoặc 4 phút chỉ thu được dung dịch màu xám đen rất đục.
Nhóm 1 Nhóm 6 Nhóm 2 Nhóm 7
Hình 3.5: Các dung dịch keo bạc nano điều chế được ở cơng suất lị 100W và 230W