3.1 KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN
3.1.1 Lựa chọn chủng ưa nhiệt
Từ tổng số 346 chủng vi sinh vật thuộc 3 bộ giống đã chọn được 91 chủng- trong đó bộ giống từ Sa Pa có 46/274 chủng, bộ giống từ Ba Vì có 29/34 chủng và bộ giống từ Phú Quốc có 16/38 chủng có khả năng sinh trưởng được ở 40oC.
3.1.2 Lựa chọn chủng có hoạt độ phytase cao
Định tính: Từ 91 chủng ưa nhiệt được nuôi trên đĩa thạch sàng lọc phytase (PSM) sau 5 ngày, lựa chọn được 2 chủng xuất hiện vùng phân giải trong là SP1901 và D15 (hình 9).
Hình 9. Sinh trưởng và vùng phân giải của phytase chủng SP1901 (trái) và D15 (phải) trên PSM
Định lượng trên môi trường lên dịch thể và lên men xốp: chúng tôi đã tiến hành lên men dịch thể chủng SP1901, D15 để sản xuất phytase trên 5 loại môi trường khác nhau, sau 3 ngày xác định hoạt tính phytase và lên men xốp trên môi trường chứa gạo lức và bột đỗ tương, sau 3,5 ngày mẫu được chiết xuất để xác định hoạt tính phytase.
Bảng 5. Hoạt tính phytase của 2 chủng SP1901 và D15 trong lên dịch thể và lên men xốp
Chủng
Hoạt tính phytase Mơi trường lên men dịch thể
(U/ml) Môi trường
lên men xốp (U/g)
G H J K1 K2
SP1901 0 0 0,63 0,35 0,26 3,9
D15 0 0 0,5 0,34 0,19 3,1
Với các kết quả thu được ở bảng 5 môi trường J cho hoạt tính phytase cao nhất ở cả 2 chủng, tuy nhiên lại thấp hơn nhiều khi so sánh với hoạt tính phytase được sinh ra trên mơi trường lên men xốp. Mặt khác, môi trường J bổ sung cơ chất Na- phytate tinh khiết rất đắt tiền, trong khi đó mơi trường lên men xốp sử dụng các cơ chất tự nhiên, dễ kiếm, rẻ tiền do đó chúng tơi quyết định sử dụng lên men xốp cho các nghiên cứu tiếp theo.
Như vậy từ 91 chủng vi sinh vật ưa nhiệt, chúng tôi đã chọn ra 2 chủng vi khuẩn là: SP1901 và D15 có sinh tổng hợp phytase trên môi trường lên men xốp. Dịch enzyme của 2 chủng này được dùng để xác định khả năng bền nhiệt.
3.1.3 Lựa chọn chủng sinh tổng hợp phytase bền nhiệt
Dịch chiết enzyme thô của 2 chủng vi khuẩn SP1901 và D15 được xử lý ở 60oC trong các khoảng thời gian 10 phút, 20 phút, 30 phút. Sau đó, tiến hành xác định hoạt tính phytase bằng định lượng, thu được kết quả như sau:
Bảng 6. Độ bền nhiệt của 2 chủng SP1901 và D15 ở 60oC
STT Chủng Nhiệt độ Thời gian xử lý (phút) Hoạt độ tương đối (%)
1 SP1901 60oC Đối chứng (0) 100 10 95,3 20 93,95 30 90 2 D15 60oC Đối chứng (0) 100 10 71,3 20 45,7 30 18,8
Như vậy, chủng SP1901 bền ở 60oC sau 30 phút xử lý, hoạt tính cịn 90%, trong khi đó chủng D15 hoạt tính chỉ cịn 45,7%. Vì thế chúng tơi lựa chọn chủng SP1901 cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2 PHÂN LOẠI
3.2.1 Xác định trình tự ADNr 16S
ADN genome của chủng vi khuẩn SP1901 được tách chiết và dùng làm khuôn
để khuếch đại ADNr 16S bằng phản ứng PCR, sử dụng cặp mồi 25F và 1525R (theo 2.2.4.1), trình tự 1500 bp được xác định. Chương trình Blast được sử dụng để so sánh độ tương đồng với trình tự của các lồi có quan hệ họ hàng gần. Cây phả hệ được xây dựng dựa trên trình tự ADNr 16S của chủng nghiên cứu và các loài
Hình 10. Cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn SP1901 và các lồi
Bacillus có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự gen 16S rRNA
Quan sát trên cây phân loại cho thấy: chủng nghiên cứu nằm cùng vị trí với
Bacillus amyloliquefaciens_NR041455 (giá trị lặp lại 77%) với mức độ tương đồng
ở trình tự ADNr 16S là 99,9%.
Hệ thống phân loại Bacillus dựa trên phân tích trình tự đoạn gen 16S rRNA bắt đầu từ những năm 1990 [8]. Hơn 20 năm qua, nhiều lồi vi khuẩn có quan hệ gần gũi với B. subtilis đã được phân lập và mơ tả. Chúng bao gồm ít nhất 9 loài là B. amyloliquefaciens, B. atrophaeus, B. axarquiensis, B. malacitensis, B. mojavensis, B. sonorensis, B. tequilensis, B. vallismortis và B. subtilis. Phương pháp phân loại
truyền thống dựa trên hình thái tế bào, bào tử cũng như các đặc tính sinh hóa khơng có khả năng phân tách các lồi này. Hơn nữa, hầu hết các lồi này đều có mức độ tương đồng đoạn gen 16S rRNA rất cao (lớn hơn 99%) mặc dù kết quả lai DNA- DNA của từng loài với B. subtilis nhỏ hơn 70%. Vì vậy, 9 lồi vi khuẩn Bacillus
này thường được chỉ định theo một thuật ngữ chung gọi là nhóm B. subtilis. Nhiều
Staphylococcus aureus_X68417 Bacillus cibi_AY550276 Bacillus indicus_AJ583158 Bacillus idriensis_AY904033 100 Bacillus isabeliae_AM503357 100 Bacillus aerophilus_AJ831844 Bacillus stratosphericus_AJ831841 Bacillus altitudinis_AJ831842 100 Bacillus safensis_AF234854 Bacillus pumilus_AY876289 100 99 Bacillus aerius_AJ831843 Bacillus licheniformis_X68416 Bacillus sonorensis_AF302118 89 Bacillus atrophaeus_AB021181 Bacillus axarquiensis_AY603657 Bacillus mojavensis_AB021191 Bacillus malacitensis_AY603656 69 Bacillus subtilis_AB042061 54 Bacillus vallismortis_AB021198 66 SP 1901 Bacillus methylotrophicus_EU194897 Bacillus amyloliquefaciens_NR041455 77 Bacillus nematotocita_AY820954 65 77 71 81 100 99 100 97 54 94 0.01
lồi trong nhóm này đã được phân tách thành các lồi phụ như B. subtilis được chia thành B. subtilis subsp. subtilis, B. subtilis subsp. spizizenii, B. subtilis subsp. inaquosorum; B. amyloliquefaciens được chia thành B. amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens và B. amyloliquefaciens subsp. plantarum [13, 85, 119].
Để phân loại chính xác đến dưới loài của chủng SP1901, chúng tôi đã thực hiện phản ứng khuếch đại và giải trình tự 6 đoạn gen: gyrase subunit A (gyrA), RNA polymerase subunit B (rpoB), phosphoibosylaminoimidazolecarbox-amide formyltransferase (purH), DNA polymerase III subunit alpha (polC), 60 kDa heat- shock protein groEL (groEL) và 16S rRNA, sử dụng các cặp mồi theo mô tả của Rooney và cộng sự, (2009) [119]. Trình tự đa gen của chủng vi khuẩn nghiên cứu có chiều dài 5547 bp được kết nối theo thứ tự đoạn 928 bp của gen gyrA, đoạn 964 bp của gen rpoB, đoạn 875 bp của gen purH, đoạn 777 bp của gen polC, đoạn 835
bp của gen groEL và đoạn 1168 bp của gen 16S rRNA. Trình tự đa gen của các lồi quan hệ gần gũi trong nghiên cứu của Rooney và cộng sự (2009) và Kobo và cộng sự (2011) được tải về từ ngân hàng gen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa vào trình tự đa gen của chủng SP1901 và các lồi trong nhóm Bacillus subtilis (hình 11).
Hình 11. Cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn SP1901 và các lồi thuộc nhóm Bacillus subtilis dựa vào trình tự kết nối 6 gen gyrA, rpoB, purH,
polC, groEL và 16S rRNA
Bacillus cereus ATCC 14579 Bacillus pumilus NRRL NRS-272
Bacillus sonorensis NRRL-B-23154 Bacillus licheniformis DMS 13
SP 1901
Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42 Bacillus amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens DSM7
100
Bacillus atrophaeus NRRL NRS-213 Bacillus mojavensis NRRL B-14698
Bacillus vallismortis NRRL B-14890 Bacillus tequilensis NRRL B-41771
Bacillus subtilis subsp. spizizenii NRRL B-23049 Bacillus subtilis subsp. inaquosorum NRRL B-23052
Bacillus subtilis subsp. subtilis NRRL NRS-744
96 80 73 100 100 100 98 100 100 100 0.02
Quan sát trên cây phân loại cho thấy: chủng nghiên cứu nằm cùng vị trí với
Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum; trong đó SP1901 sai khác 54 bp với Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42 (tương đương 99%) và sai
khác 162 bp với Bacillus amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens DSM7 (tương đương 97%). Kết quả phân tích cho thấy chủng nghiên cứu được xếp vào nhóm lồi
B. amyloliquefaciens subsp. plantarum và phân tách rõ ràng với nhóm lồi B. amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens cũng như những lồi khác trong nhóm B. subtilis.
3.2.2 Đặc điểm hình thái
Hình 12. Hình thái tế bào (trái) và khuẩn lạc (phải) của chủng SP1901
Hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng SP1901 được quan sát (hình 13): ▪ Hình thái khuẩn lạc: Khuẩn lạc bề mặt xù xì, màu trắng, mép răng cưa, khơng tiết sắc tố ra mơi trường, kích thước khuẩn lạc 1-3 mm.
▪ Hình thái tế bào: tế bào có dạng hình que, ngắn, có kích thước (3,2 - 3,9) x (0,9-1,0) μm.
Dựa vào đặc điểm hình thái và so sánh mức độ tương đồng ADNr 16S và trình tự 6 gen kết nối (gyrA, rpoB, purH, polC, groEL và 16S rDNA) của chủng nghiên cứu và các lồi có quan hệ họ hàng gần, chủng SP1901 được định danh là B. amyloliquefaciens subsp. plantarum.
Bacillus amyloliquefaciens là một loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus được phát hiện trong đất năm 1943, Bacillus amyloliquefaciens là một vi sinh vật an tồn
(GRAS) do đó B. amyloliquefaciens được biết đến với nhiều ứng dụng trong sản
xuất các sản phẩm thương mại như sản xuất enzyme công nghiệp [38, 104]. Nhiều chất kháng sinh có bản chất peptide tổng hợp không qua ribosome cũng đã được cơng bố từ lồi B. amyloliquefaciens như bacylicin, lipopeptide (surfactin, fengycin, iturin và bacillomycin) và polyketide (difficidin, bacillaene và macrolactin) [6, 7, 121]. B. amyloliquefaciens có thể được dùng như probiotics để bổ sung vào thức ăn hoặc nước uống.
3.3 NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY
3.3.1 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy giống
a/ Mơi trường thích hợp cho sự sinh trưởng
Chủng nghiên cứu được nuôi cấy trên 5 môi trường khác nhau và sinh khối được xác định theo phương pháp đếm số lượng tế bào trên 1 ml dịch nuôi cấy. Kết quả thu được như sau:
Hình 13. Mơi trường nhân giống thích hợp chủng SP1901
Như vậy mơi trường thạch dinh dưỡng NA thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của chủng SP1901 với mật độ tế bào 41×109 /ml dịch ni cấy sau 24 h (hình 13).
Sau 1 ngày ni cấy lắc ở mơi trường dịch thể có pH từ 3 - 9, ở 37oC, khả năng sinh trưởng của chủng vi sinh vật được xác định bằng số lượng tế bào/ml dịch ni cấy.
Hình 14. pH thích hợp cho sinh trưởng chủng SP1901
Hình 15. Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng chủng SP1901
Với kết quả thu được ở hình 14 chủng vi khuẩn nghiên cứu có khả năng sinh trưởng được trong dải pH từ 5,12 đến 8,5 nhưng pH thích hợp nhất cho sinh trưởng của chủng nghiên cứu là pH 6 (5,98), ở pH 3,15 và pH 4,22 chủng vi khuẩn gần như không sinh trưởng.
Để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng của chủng nghiên cứu, chủng SP1901 được nuôi cấy lắc ở lần lượt các nhiệt độ 20-55oC, khả năng sinh trưởng của chủng vi sinh vật được xác định bằng số lượng tế bào/ml dịch ni cấy. Theo kết quả thu được ở hình 15 nhiệt độ thích hợp nhất cho sinh trưởng của chủng nghiên cứu là 40oC với 51×109 tế bào/ml.
c/ Thời gian thích hợp cho sự sinh trưởng
Sau các khoảng thời gian nuôi cấy lắc 8, 16, 24, 32, 40 và 48 h số lượng tế bào/ml dịch nuôi cấy được xác định.
Hình 16. Thời gian thích hợp cho sinh trưởng chủng SP1901
Theo kết quả thu được ở hình 16, thời gian thích hợp nhất cho sinh trưởng của chủng vi sinh vật nghiên cứu là từ 16-24 h, đạt khoảng 52×109 tế bào/ml.
d/ Chế độ thơng khí
Sau 1 ngày ni cấy chủng nghiên cứu ở các chế độ thơng khí là: ni lắc, ni tĩnh và ni kị khí, mật độ tế bào của chủng vi khuẩn được xác định.
Hình 17. Chế độ thơng khí thích hợp cho sinh trưởng chủng SP1901
Như vậy, chủng nghiên cứu sinh trưởng tốt nhất ở điều kiện ni cấy hiếu khí (ni lắc) (hình 17).
Giống khởi động được dùng để cấy vào các mơi trường lên men xốp, đóng vai trị rất quan trọng đối với q trình lên men xốp sau đó đặc biệt là lượng sinh khối
và chất lượng giống. Các yếu tố này được quyết định bởi các điều kiện nhân giống như môi trường, pH, nhiệt chế độ thơng khí và thời gian (quyết định tuổi của giống) tạo điều kiện tối đa cho sự phát triển sinh khối. Với các kết quả thu được, chúng tôi nhận thấy điều kiện nhân giống thích hợp nhất cho chủng SP1901 là nhân giống trên môi trường dịch thể NA ở 40oC, pH 6 và nuôi trong điều kiện lắc 200 vòng/ phút. Số lượng tế bào đạt được cao nhất sau 16-24 h nuôi cấy.
3.3.2 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy xốp
a/ Lựa chọn cơ chất xốp thích hợp
Chủng vi khuẩn nghiên cứu sau 3 ngày nuôi trên 8 loại cơ chất khác nhau tại 40oC, dịch chiết enzyme thơ được xác định hoạt tính phytase. Kết quả được thể hiện trong hình 18:
Hình 18. Cơ chất thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901
Một trong những ưu điểm của lên men xốp là môi trường nuôi cấy khá giống với môi trường tự nhiên của vi sinh vật, cơ chất có ảnh hưởng đáng kể lên q trình lên men xốp. Cơ chất đóng vai trị kép vừa là nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật, vừa là giá thể để các tế bào vi sinh vật bám vào [132]. Các loại cơ chất dùng trong lên men xốp có thể mua được dễ dàng ngoài chợ hay là các sản phẩm phụ của q trình
chế biến cơng nơng nghiệp như ngô, gạo lức, cám, bột đỗ tương. Trong nghiên cứu này, hoạt tính enzyme đạt được cao nhất của B. amyloliquefaciens subsp. plantarum SP1901 khi lên men xốp với cơ chất là ngô vỡ (4,68 U/g). Vì thế cơ chất ngơ vỡ được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
b/ Lựa chọn độ ẩm thích hợp
Chủng vi khuẩn nghiên cứu sau 3 ngày nuôi xốp trên cơ chất thích hợp tại 40oC với các độ ẩm 20-90%. Dịch chiết enzyme thô được xác định hoạt tính phytase. Kết quả được thể hiện trong hình 19.
Hình 19. Độ ẩm thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901
Hình 20. Tỷ lệ cấy giống thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901
Độ ẩm có tác động trực tiếp đến q trình sinh trưởng cũng như quá trình sinh tổng hợp enzyme trong lên men xốp bởi vì quá trình lên men xốp rất khác với lên men chìm, trong lên men xốp vi sinh vật sinh trưởng và sinh tổng hợp các sản phẩm bên trên hoặc gần bề mặt cơ chất có độ ẩm thấp do đó mà lên men xốp chỉ thích ứng với một số giới hạn các loại vi sinh vật [132]. Trong nghiên cứu này, độ ẩm thích hợp nhất cho hoạt tính phytase cao nhất ở chủng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum SP1901 là 50%. Ở độ ẩm 20-30%, chủng vi khuẩn nghiên cứu gần như
không sinh trưởng; ở độ ẩm 90% vi khuẩn mọc thành lớp trên bề mặt cơ chất xốp mà sinh trưởng kém bên trong khối cơ chất. Độ ẩm thích hợp trong q trình lên men xốp cịn phụ thuộc vào độ ẩm sẵn có của loại cơ chất sử dụng. Độ ẩm thích hợp
nhất của 3 chủng nấm A. ficuum NRRL 3135, M. racemosus NRRL 1994, R. oligosporus NRRL 5905 khi lên men xốp sử dụng cơ chất là bột ngô, cám lúa mỳ,
bột đỗ tương là 60%, tuy nhiên khi lên men xốp trên bột canola thì độ ẩm thích hợp nhất là 70% [12].
c/ Lựa chọn tỷ lệ cấy giống thích hợp
Chủng nghiên cứu được nuôi lắc khởi động trong môi trường dịch thể NA và giống cấy vào môi trường lên men xốp với các tỷ lệ khác nhau và đảm bảo độ ẩm 50%, hoạt tính phytase của dịch enzyme được xác định. Kết quả thu được trong hình 20. Tỷ lệ cấy giống đóng một vai trị quan trọng trong q trình sinh tổng hợp phyatase ở lên men pha rắn. Tỷ lệ cấy giống quá lớn làm giảm sản lượng phytase sinh ra là do các yếu tố dinh dưỡng tập trung tăng cường cho quá trình sản xuất sinh khối. Do đó tỷ lệ cấy giống cần thích hợp cho sự sinh trưởng cũng như quá trình sinh tổng hợp phytase. Theo kết quả thu được ở hình 20, tỷ lệ cấy giống thích hợp nhất cho chủng chủng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum SP1901 sinh tổng hợp phytase trong lên men xốp là trong khoảng 10-20% (dựa trên khối lượng ngô vỡ). Ở tỷ lệ cấy giống từ 25%, hoạt tính phytase thu được giảm dần.
d/ Lựa chọn thời gian ni cấy thích hợp
Chủng nghiên cứu được nuôi trên môi trường ngô vỡ ở 37oC, sau các khoảng thời gian thích hợp lấy mẫu, xác định số lượng và chiết enzyme để xác định hoạt tính phytase. Kết quả thu được như hình 21.
Hình 21. Ảnh hưởng của thời gian ni cấy lên sinh khối và hoạt tính phytase của chủng SP1901
Với kết quả thu được, số lượng tế bào/g cơ chất của chủng vi khuẩn đạt được cao nhất sau khoảng 48-72 h, tuy nhiên hoạt tính phytase đạt được cao nhất trong khoảng thời gian 84 h nuôi cấy. Quá trình lên men xốp thường diễn ra trong thời gian dài hơn so với lên men chìm, kết quả thu được cũng phù hợp với nghiên cứu