Một trong những ưu điểm của lên men xốp là môi trường nuôi cấy khá giống với môi trường tự nhiên của vi sinh vật, cơ chất có ảnh hưởng đáng kể lên q trình lên men xốp. Cơ chất đóng vai trị kép vừa là nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật, vừa là giá thể để các tế bào vi sinh vật bám vào [132]. Các loại cơ chất dùng trong lên men xốp có thể mua được dễ dàng ngoài chợ hay là các sản phẩm phụ của q trình
chế biến cơng nơng nghiệp như ngơ, gạo lức, cám, bột đỗ tương. Trong nghiên cứu này, hoạt tính enzyme đạt được cao nhất của B. amyloliquefaciens subsp. plantarum SP1901 khi lên men xốp với cơ chất là ngơ vỡ (4,68 U/g). Vì thế cơ chất ngô vỡ được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
b/ Lựa chọn độ ẩm thích hợp
Chủng vi khuẩn nghiên cứu sau 3 ngày nuôi xốp trên cơ chất thích hợp tại 40oC với các độ ẩm 20-90%. Dịch chiết enzyme thô được xác định hoạt tính phytase. Kết quả được thể hiện trong hình 19.
Hình 19. Độ ẩm thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901
Hình 20. Tỷ lệ cấy giống thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901
Độ ẩm có tác động trực tiếp đến q trình sinh trưởng cũng như quá trình sinh tổng hợp enzyme trong lên men xốp bởi vì quá trình lên men xốp rất khác với lên men chìm, trong lên men xốp vi sinh vật sinh trưởng và sinh tổng hợp các sản phẩm bên trên hoặc gần bề mặt cơ chất có độ ẩm thấp do đó mà lên men xốp chỉ thích ứng với một số giới hạn các loại vi sinh vật [132]. Trong nghiên cứu này, độ ẩm thích hợp nhất cho hoạt tính phytase cao nhất ở chủng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum SP1901 là 50%. Ở độ ẩm 20-30%, chủng vi khuẩn nghiên cứu gần như
không sinh trưởng; ở độ ẩm 90% vi khuẩn mọc thành lớp trên bề mặt cơ chất xốp mà sinh trưởng kém bên trong khối cơ chất. Độ ẩm thích hợp trong q trình lên men xốp cịn phụ thuộc vào độ ẩm sẵn có của loại cơ chất sử dụng. Độ ẩm thích hợp
nhất của 3 chủng nấm A. ficuum NRRL 3135, M. racemosus NRRL 1994, R. oligosporus NRRL 5905 khi lên men xốp sử dụng cơ chất là bột ngô, cám lúa mỳ,
bột đỗ tương là 60%, tuy nhiên khi lên men xốp trên bột canola thì độ ẩm thích hợp nhất là 70% [12].
c/ Lựa chọn tỷ lệ cấy giống thích hợp
Chủng nghiên cứu được nuôi lắc khởi động trong môi trường dịch thể NA và giống cấy vào môi trường lên men xốp với các tỷ lệ khác nhau và đảm bảo độ ẩm 50%, hoạt tính phytase của dịch enzyme được xác định. Kết quả thu được trong hình 20. Tỷ lệ cấy giống đóng một vai trị quan trọng trong q trình sinh tổng hợp phyatase ở lên men pha rắn. Tỷ lệ cấy giống quá lớn làm giảm sản lượng phytase sinh ra là do các yếu tố dinh dưỡng tập trung tăng cường cho quá trình sản xuất sinh khối. Do đó tỷ lệ cấy giống cần thích hợp cho sự sinh trưởng cũng như quá trình sinh tổng hợp phytase. Theo kết quả thu được ở hình 20, tỷ lệ cấy giống thích hợp nhất cho chủng chủng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum SP1901 sinh tổng hợp phytase trong lên men xốp là trong khoảng 10-20% (dựa trên khối lượng ngô vỡ). Ở tỷ lệ cấy giống từ 25%, hoạt tính phytase thu được giảm dần.
d/ Lựa chọn thời gian ni cấy thích hợp
Chủng nghiên cứu được ni trên mơi trường ngô vỡ ở 37oC, sau các khoảng thời gian thích hợp lấy mẫu, xác định số lượng và chiết enzyme để xác định hoạt tính phytase. Kết quả thu được như hình 21.
Hình 21. Ảnh hưởng của thời gian ni cấy lên sinh khối và hoạt tính phytase của chủng SP1901
Với kết quả thu được, số lượng tế bào/g cơ chất của chủng vi khuẩn đạt được cao nhất sau khoảng 48-72 h, tuy nhiên hoạt tính phytase đạt được cao nhất trong khoảng thời gian 84 h nuôi cấy. Quá trình lên men xốp thường diễn ra trong thời gian dài hơn so với lên men chìm, kết quả thu được cũng phù hợp với nghiên cứu của Gulati và cộng sự (2007) khi tiến hành lên men dịch thể để sinh tổng hợp phytase ở chủng Bacillus laevolacticus, hoạt tính phytase đạt được cao nhất chỉ sau 60h nuôi cấy [37].
e/ Lựa chọn nguồn cacbon và nguồn nitơ bổ sung thích hợp
Chủng nghiên cứu được nuôi cấy trên môi trường lên men xốp được bổ sung các nguồn các bon khác nhau vào dung dịch làm ẩm như: galactose, sucrose, lactose, xylose, manitol, glycerol, CMC và tinh bột tan (tỷ lệ 1%) và các nguồn nitơ khác nhau như: (NH4)2SO4, NaNO2, NaNO3, ure, cao thịt, cao men, peptone (tỷ lệ 0,5%) và mẫu đối chứng âm là mẫu không bổ sung nguồn các bon/nguồn nitơ, mẫu đối chứng dương là mơi trường ngơ vỡ làm ẩm bằng dịch khống. Sau 3 ngày nuôi cấy ở 40oC dịch enzyme thơ được xác định hoạt tính phytase. Kết quả thu được như trong hình 22 và 23.
Hình 22. Nguồn các bon thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901
Hình 23. Nguồn nitơ thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901
Các kết quả thu được ở hình 22 cho thấy B. amyloliquefaciens subsp. plantarum SP1901 có thể sử dụng nhiều nguồn cacbon khác nhau và nguồn cacbon
cũng ảnh hưởng đến quá trình sản sinh phytase ngoại bào của B. amyloliquefaciens subsp. plantarum SP1901. Trong số các nguồn cacbon được kiểm tra, lactose và
glycerol (1%) hỗ trợ tốt nhất cho quá trình sinh tổng phytase. Thêm vào đó, hoạt tính phytase cao cũng được tìm thấy ở mơi trường có bổ sung sucro và CMC. Trong mẫu đối chứng không bổ sung nguồn cacbon hoạt tính phytase đạt 4,53 U/g, điều này chứng tỏ rằng SP1901 có thể sử dụng nguồn cacbon sẵn có trong cơ chất. Ngồi nguồn cacbon thì các nguồn nitơ khác nhau có ảnh hưởng đến q trình sinh tổng hợp phytase. Các kết quả trong hình 23 chỉ ra rằng ure và NH4NO3 có ảnh hưởng tích cực sản xuất phytase; (NH4)2SO4 và peptone ức chế quá trình sản xuất phytase (tương ứng hoạt tính phytase chỉ cịn 1,77 và 1,93 U/g). Ngồi ra, chủng SP1901 có khả năng sử dụng được nhiều nguồn nitơ khác nhau, thậm chí có thể khơng cần bổ sung thêm nguồn nitơ bên ngồi mà có thể sử dụng được nguồn nitơ có mặt ngay trong cơ chất xốp. Gulati và cộng sự (2007) đã cho rằng quá trình sản xuất phytase bởi Bacillus laevolacticus được kích thích nhờ sự có mặt của NH4H2PO4 và sucrose [37]. Những nghiên cứu trước đây cho rằng cám mỳ là nguồn cacbon thích hợp nhất cho sản xuất phytase ở B. amyloliquefaciens DS11, B. subtilis, và B.
amyloliquefaciens FZB45; tuy nhiên lại khơng có ảnh hưởng tích cực đến q trình
sản xuất phytase ở B. laevolacticus [37, 57]. Tinh bột là nguồn cacbon và
(NH4)2SO4 là nguồn nitơ bổ sung thích hợp nhất làm tăng q trình sản xuất phytase ở A. ficuum NRRL 3135, M. racemosus NRRL 1994, R. oligosporus NRRL 5905;
hay manitol 2,05% là nguồn cacbon và amoniumsunlfate 2,84% là nguồn nitơ thích hợp nhất làm tăng 8,41 lần sự sản xuất phytase ở Rhizopus oryzae [12, 107].
f/ Lựa chọn các ion kim loạibổ sung thích hợp
Chủng nghiên cứu được nuôi cấy trên môi trường lên men xốp được bổ sung một trong các ion kim loại như : Ca2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+, Cu2+, Ba2+, K+, Na+, Fe2+ (tỷ lệ 0,2%) vào dung dịch làm ẩm và mẫu đối chứng âm là mẫu không bổ sung ion kim loại, mẫu đối chứng dương là môi trường ngô vỡ được làm ẩm bằng dịch khoáng. Sau 3 ngày nuôi cấy ở 40oC dịch enzyme được xác định hoạt tính phytase. Kết quả thu được như trong hình 24.
Hình 24. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến khả năng sinh tổng hợp phytase của chủng SP1901
Theo kết quả thu được hoạt tính phytase của chủng nghiên cứu cao nhất khi nuôi cấy trên môi trường chỉ bổ sung Ca2+ và mơi trường đối chứng có mặt của Ca2+ và 1 số ion kim loại như Mg2+, Mn2+, K+, Fe2+. Tuy nhiên trong môi trường đối
chứng khơng có bổ sung ion kim loại và mơi trường chỉ bổ sung 1 trong các loại ion kim loại (Mg2+, Mn2+, Zn2+, Cu2+, Ba2+, K+, Na+, Fe2+), chủng nghiên cứu gần như khơng có sự sinh tổng hợp phytase. Điều này cho thấy Ca2+ có ảnh hưởng rất lớn trong quá trình sinh trưởng cũng như sinh tổng hợp phyatse của chủng SP1901 và có thể giải thích là do phytases từ B. subtilis và B. amyloliquefaciens là các phytase phụ thuộc Ca2+, chúng có chứa trung tâm hoạt động có ái lực cao với Ca2+ [40]. Choi và cộng sự (1999) cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của các ion kim loại lên sự sinh tổng hợp phytase của chủng Bacillus sp. KHU-10 trong lên men dịch thể, thấy rằng khi bổ sung 0,01-0,2% Ca2+, Zn2+ 0,1% vào môi trường nuôi cấy làm tăng sự sản xuất phytase lên khoảng 30% so với môi trường không bổ sung Ca2+, sự có mặt của các ion khác như Cu2+, Fe2+, Fe3+, K+, Li+, Na+ và Sn2+ làm giảm một phần hoạt tính phytase mà khơng ức chế hồn tồn q trình sinh tổng hợp phytase [20].
h/ Lựa chọn hàm lượng Ca2+ bổ sung thích hợp
Dựa trên kết quả về vai trị quyết định của Ca2+ đối với q trình sinh tổng hợp phytase, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu nồng độ ion Ca2+
bổ sung thích hợp vào môi trường lên men xốp: 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1; 1,2% , mẫu đối chứng âm không bổ sung Ca2+, sau 3 ngày nuôi cấy ở 40oC, dịch enzyme được xác định hoạt tính phytase. Kết quả thu được như sau:
Hình 25. Ảnh hưởng của hàm lượng Ca2+ đến khả năng sinh tổng hợp phytase của chủng SP1901
Theo kết quả nghiên cứu, hàm lượng Ca2+ thích hợp nhất cho sự sinh tổng hợp phytase của chủng SP1901 là từ 0,1-1%; từ 1,2% Ca2+ được bổ sung thì hoạt tính phytase bắt đầu giảm xuống (hình 25).
Với những kết quả thu được khi tối ưu hóa các điều kiện lên men xốp của chủng SP1901, ngơ vỡ là cơ chất thích hợp nhất cho quá trình sản xuất phytase, độ ẩm 50% và tỷ lệ cấy giống từ 10-20% tạo điều kiện thuận lợi cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp phytase và hoạt tính phytase đạt được cao nhất sau 84 h nuôi cấy. Chủng SP1901 có thể sử dụng nguồn cacbon và nitơ sẵn có trong cơ chất tuy nhiên khi có mặt lactose, glycerol, ure và NH4NO3 cũng làm tăng nhẹ hoạt tính phytase thu được. Ion Ca2+
có vai trị quyết định đối với q trình sản sinh phytase ở nồng độ thích hợp từ 0,1-1%, các mơi trường khơng có mặt Ca2+ đều khơng có sự sinh tổng hợp phytase của chủng SP1901.
3.4 THU HỒI ENZYME
3.4.1 Thu hồi enzyme bằng các dung dịch chiết khác nhau
Chủng nghiên cứu sau 3,5 ngày nuôi cấy trên môi trường lên men xốp thích hợp được chiết xuất enzyme bằng 7 dung dịch chiết khác nhau với 3 lần chiết và xác định hoạt tính phytase. Kết quả thu được như sau:
Theo kết quả thu được ở lần chiết 1, dung dịch chiết chứa SDS 1% (một chất hoạt động bề mặt mang tính ion âm) và nước máy có khả năng thu hồi hoạt tính phytase cao nhất, khi chiết lần 2 hoạt tính phytase thu hồi chỉ còn từ 12-50% và trong lần chiết xuất thứ 3 hoạt tính phytase hết hồn tồn. Hoạt tính thu hồi được của nước máy và dịch chiết chứa SDS 1% gần tương đương nhau do đó xét về tính kinh tế có thể sử dụng nước máy trong việc thu hồi enzyme phytase từ dịch lên men xốp của chủng SP1901 (hình 26). Đối với từng vi sinh vật khác nhau lên men trên các loại mơi trường khác nhau thì việc sử dụng các dung dịch đệm khác nhau cũng ảnh hưởng nhiều đến quá trình thu hồi enzyme. Trong nghiên cứu của Rezaei và cộng sự (2011) trên đối tượng là cỏ switchgrass được bổ sung enzyme xylanase thương mại (nguồn gốc nấm sợi) hoặc được lên men xốp bởi chủng Axitothermus cellulolyticus cho thấy đối với mẫu cỏ switchgrass (một loại cỏ bản địa Bắc Mỹ)
được lên men xốp bởi A. cellulolyticus, nước được coi là một đệm chiết xuất ưa
thích để thu hồi xylanase, trong khi đó với mẫu cỏ switchgrass được bổ sung enzyme thương mại nguồn gốc nấm thì đệm natri acetate 50mM là một đệm chiết xuất lý tưởng. Ngoài ra trong quá trình chiết xuất enzyme có thể sử dụng lọc tiếp tuyến phản hồi nhằm làm tăng hoạt tính enzyme thu hồi do lọc tiếp tuyến có khả năng loại bỏ các chất ức chế sẵn có trong cơ chất và các hợp chất sinh ra trong quá trình phân hủy cơ chất như các hợp chất phenolic….Trong nghiên cứu của Maria Inês Rezende và cộng sự (2012), khi chiết xuất xylanse bằng 3 loại dung dịch chiết là nước, Tween 80 0,1% trong muối sinh lý và đệm natri acetate 50 mM pH 5 khơng có sự khác biệt nhiều trong hoạt tính enzyme thu được [73].
3.4.2 Tủa enzyme bằng các dung môi khác nhau
a/ Tủa bằng amoniumsulphate
Dịch chiết enzyme từ q trình lên men xốp trên cơ chất thích hợp ở 40oC sau 3 ngày, được tủa bằng muối amoniumsulphate ở các phân đoạn khác nhau. Kết quả cho thấy khi tủa enzyme bằng các phân đoạn khác nhau với muối (NH4)2SO4, hoạt tính phytase mất hồn tồn ở tất cả các phân đoạn. Do đó khơng thể sử dụng muối (NH4)2SO4 khi tủa phytase trong trường hợp này, tuy nhiên theo nhiều nghiên cứu
của các tác giả khác như Kenruvo và cộng sự (1998) đã tủa phytase bằng (NH4)2SO4 65% và thu hồi được 56% hoạt tính phytase, theo Wang xueying và cộng sự (2003) đều thu hồi được phytase ở các phân đoạn từ 20-80% (NH4)2SO4 [54, 153].
b/ Tủa bằng cồn và acetone
Dịch chiết enzyme từ quá trình lên men xốp trên ở 40oC sau 3 ngày, được tủa bằng cồn và acetone ở các nồng độ khác nhau và kết quả thu được trong hình 27:
Hình 27. Tủa enzyme bằng cồn và aceton
Khi tủa enzyme bằng cồn và aceton cho thấy ở nồng độ 70% cồn và aceton cho hoạt tính phytase cao nhất (đạt 91-95%). Trong nghiên cứu của Keruvo và cộng sự (1998) đã sử dụng cồn 75% để tủa phytase và thu hồi được 93% hoạt tính phytase [54].
3.5 NGHIÊN CỨU ENZYME PHYTASE CỦA CHỦNG SP1901
3.5.1 Phân tích trình tự gen phytase và so sánh với các lồi có quan hệ gần gũi
ADN genome của chủng vi khuẩn SP1901được tách chiết và dùng làm khuôn để khuếch đại gen mã hóa phytase (gen phytase) bằng phản ứng PCR, sử dụng cặp mồi FAR22 và FAR06 (theo 2.2.7.1), trình tự gen phytase được xác định. Chương
trình Blast được sử dụng để so sánh độ tương đồng với trình tự của các lồi có quan hệ họ hàng gần. Cây phả hệ được xây dựng dựa trên trình tự gen phytase của chủng nghiên cứu và các loài Bacillus có quan hệ họ hàng (hình 28).
Trình tự gen phytase chủng SP1901 gồm 1175 bp, được so sánh độ tương đồng với các chủng thuộc nhóm Bacillus substilis khác đã được công bố trên Genbank.
Cây phân loại được xây dựng dựa vào trình tự của gen phytase của chủng SP1901 và 33 chủng khác thuộc nhóm Bacillus substilis được thể hiện trong hình 28.
Hình 28. Cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn SP1901 và các lồi
Bacillus có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự gen mã hóa phytase
Kết quả cho thấy chủng SP1901 có độ tương đồng 97% với trình tự gen phytase của chủng Bacillus amyloliquefaciens FZB42, 97% với trình tự gen phytase
Bacillus subtilis E20_FJ541287
B. amyloliquefaciens subsp plantarum CAU B946_HE617159 Bacillus subtilis_AJ584664
64
Bacillus sp. MD2_GU143090 Bacillus sp. DS11_U85968
72
Bacillus subtilis_WYCQ02_FJ986327
79
Bacillus subtilis_ARRMK33 _EF092835 Bacillus subtilis_AF292103
Bacillus subtilis IDCC 1102_DQ346197
86 Bacillus amyloliquefaciens FZB42_CP000560 100 Bacillus sp. HQ730912_B13 62 SP 19.01 89 Bacillus sp. SDBZ4_GU198969 Bacillus subtilis_AF298179
Bacillus subtilis B9601-Y2 _EU624118
Bacillus amyloliquefaciens_FZB45_ AY055220
B.amyloliquefaciens subsp plantarum YAU B9601-Y2_HE774679 Bacillus amyloliquefaciens Y2_CP00333
Bacillus subtilis WHNB02_AY220075 Bacillus sp. SD01N_AY518208 48 74 64 61 62 82 98 68 57 Bacillus amyloliquefaciens LL3_CP002634 Bacillus amyloliquefaciens TA208_CP002627 Bacillus amyloliquefaciens XH7_CP002927 93 Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061 HM747163 92 Bacillus amyloliquefaciens_AF453255 93 Bacillus amyloliquefaciens DSM7_FN597644
Bacillus amyloliquefaciens BAP_AY836773 Bacillus subtilis ATCC 12711_JQ437256
100
Bacillus subtilis McCoyRa_JN886002
100
Bacillus subtilis_AF029053
100
Bacillus subtilis_AJ277890
100
Bacillus subtilis US417 _AM501550
100 Bacillus subtilis XF-8_HM070997 99 97 100 100 0.01
của chủng Bacillus sp. B13, 96% với trình tự gen phytase của chủng Bacillus sp. DS11, 90% với trình tự gen phytase của Bacillus amyloliquefaciens DSM7. Trong cây phát sinh được xây dựng dựa trên trình tự gen phytase, các loài Bacillus