Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. Thành phần axit béo của mười VTBDD thraustochytrid
3.4.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Ngồi bổ sung nguồn cacbon thì khả năng sinh trưởng và tổng hợp Lipit của VTBDD cũng chịu sựảnh hưởng của nguồn nitơ. Kết quảđược thể hiện trong bảng 3.7. Với nguồn nitơ ban đầu là cao nấm men, tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh Lipit cao nhất so với 4 nguồn nitơ khác. Lipit tổng sốđạt 18,87%; 17,48% TLK với hai chủng PT-279, PT-272. Trọng lượng khô của cả mười VTBDD này đều tương đối cao, trong khoảng từ9,01 đến 15,9 g/l. Trong khi đó với nguồn nitơ thay thế là pepton tốc độ sinh trưởng giảm 0,5 – 2 lần so với nguồn nitơ là cao nấm men, nhưng Lipit tổng số sau tách chiết thu được của chủng PT-286 đạt 18,03% TLK. Các chủng PT-271, PT-272, PT-277, PT-278, PT-281 và PT-283, Lipit tổng số sau tách chiết lần lượt là 14,15; 15,81; 16,90; 14,31; 13,24 và 14,63% TLK. Kết quả này cho thấy cả tốc độ sinh trưởng và Lipit tổng số với nguồn nitơ hữu cơ đều tốt hơn so với nguồn nitơ vô cơ. Chủng PT-286 khi bổ sung nitơ là NaNO3, KNO3 thì hàm lượng Lipit khơng có sự chênh lệch nhiều, bằng 4,6% và 5,5% TLK. Điều đáng chú ý là, khi nuôi VTBDD này trên nguồn nitơ (NH4)2SO4cho hàm lượng Lipit thấp
chỉ đạt 1,05%. Với VTBDD chủng PT-280, khi bổ sung nguồn nitơ từ KNO3 sẽ cho
hàm lượng Lipit thấp (1,21%). Nuôi VTBDD này trên các nguồn nitơ khác như
(NH4)2SO4, NaNO3 cho hàm lượng Lipit có sự lênh lệch không đáng kể (6,45% và 6% TLK).
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến sinh trưởng và Lipit tổng số của mười VTBDD thraustochytrid
Chủng
Nguồn Nitơ 1%
Cao nấm men Peptone (NH4)2SO4 KNO3 NaNO3
TLK (g/l) Lipit tổng số (%TLK) TLK (g/l) Lipit tổng số (%TLK) TLK (g/l) Lipit tổng số (%TLK) TLK (g/l) Lipit tổng số (%TLK) TLK (g/l) Lipit tổng số (%TLK) PT-268 13,95 12,79 12,67 5,36 6,08 1,05 5,00 5,50 11,1 4,60 PT-271 15,90 11,79 7,00 14,15 5,70 3,18 4,50 8,56 2,46 3,00 PT-272 15,45 17,48 10,61 15,81 5,40 3,70 5,30 2,83 4,02 1,44 PT-277 13,35 14,61 8,34 16,90 2,57 5,60 4,30 4,65 4,30 3,63 PT-278 10,54 11,29 7,73 14,31 8,64 3,24 2,70 4,63 5,20 6,00 PT-279 9,01 18,87 7,11 6,96 3,50 9,20 3,20 6,25 4,80 5,83 PT-280 13,50 11,11 7,52 6,85 6,20 6,45 3,50 1,21 3,70 6,00 PT-281 12,60 11,90 8,76 13,24 6,40 5,47 3,70 2,16 6,80 7,35 PT-283 15,75 8,57 8,45 14,63 3,80 7,89 2,70 2,04 6,60 4,61 PT-286 10,35 10,14 6,28 18,03 7,07 5,45 2,80 3,57 2,60 6,46
Từ kết quả của các nghiên cứu trên cho thấy khi bổ sung cao nấm men là nguồn nitơ là thích hợp nhất cho các VTBDD. Những kết quả này hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của Shene et al. (2010), khi nuôi VTBDD trên nguồn nitơ hữu
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
1. Đã phân lập được 10 chủng VTBDD từ các mẫu lá rụng ở 6 vị trí khác nhau
trong vùng đệm và vùng lõi quanh RNM Xuân Thủy, Nam Định. Với các đặc
điểm hình thái khác nhau về cả hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào.
2. Kết quả phân tích trình tự gen 18S rRNA của 10 chủng đã cho thấy rằng có hai loại khác nhau cho gen 18S rRNA trong bộ gen của các chủng thraustochytrid phân lập được, cho thấy rằng các chủng thraustochytrid trong nghiên cứu này có thể thuộc về một nhóm các giống lai mới giữa hai lồi vi tảo. Phân tích một
chủng đại diện (PT-268) cho thấy có hai loại trình tự khác nhau cho gen 18S
rRNA hiện có trong bộ gen của các chủng VTBDD này. Những loại trình tự rRNA 18S này (loại 1 và loại 2) có liên quan chặt chẽ với hai loài
Aurantiochytrium khác nhau.
3. Sựsinh trưởng của cảmười VTBDD đạt cao nhất khi sử dụng nguồn cacbon là glucose, trọng lượng khô thu được sau 72 giờ nuôi đạt từ 9 đến 18,48 g/l và Lipit tổng số là 7 – 12,35% TLK. Và nguồn nitơ là cao nấm men, trọng lượng khô của mười chủng VTBDD đạt từ 9,01 đến 15,9 g/l, Lipit tổng số trong khoảng 8,57-18,87% TLK. Cảmười chủng VTBDD đều có khảnăng sinh tổng
hợp lượng lớn DPA (20,22-39,35% TFA) và EPA (0,2-1,95% TFA).
Kiến nghị
1. Thực hiện các kỹ thuật như lai DNA Southerm blot phân tích để xác minh giả thiết tồn tại giống lai của hai loài VTBDD khác nhau.
2. Tối ưu nuôi cấy các chủng VTBDD thraustochytrid trên các hệ thống lên men
quy mô lớn nhằm ứng dụng các chủng thraustochytrid trong nuôi trồng hải sản và sản xuất PUFA, DHA... đại trà.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Abulencia C. B., Wyborski D. L., Garcia J. a, Podar M., Chen W., et al. (2012) “Biosynthesis of Polyketides in Heterologous Hosts,” Appl. Environ.
Microbiol., vol. 65, no. 1, pp. 106–118.
2. Arafiles K. H. V., Alcantara J. C. O., Batoon J. a. L. (2011) “Cultural optimization of thraustochytrids for biomass and fatty acid production,”
Mycosphere, vol. 2, no. 5, pp. 521–531.
3. Barclay W. R., Meager K. M., Abril J. R. (1994) “Heterotrophic production of long chain omega-3 fatty acids utilizing algae and algae-like microorganisms,” J. Appl. Phycol., vol. 6, no. 2, pp. 123–129.
4. Beakes G. W., Honda D., Thines M. (2006) “Systematics of the Straminipila: Labyrinthulomycota, Hyphochytriomycota, and Oomycota,” in THE
MYCOTA: A Comprehensive Treatise on Fungi as Experimental Systems for Basic and Applied Research, Second., Esser, K., D. J. McLaughlin, and J. W.
Spatafora, Eds. Springer, 2006, pp. 39–99.
5. Beser J., Hagblom P., Fernandez V. (2007) “Frequent in vitro recombination in internal transcribed spacers 1 and 2 during genotyping of Pneumocystis jirovecii,” J. Clin. Microbiol., vol. 45, no. 3, pp. 881–886.
6. Blight E. G., Dyer W. J. (1959) “Canadian Journal of Biochemistry and Physiology,” Can. J. Biochem. Physiol, vol. 37.
7. Bongiorni L. (2012) “Thraustochytrids, a neglected component of organic matter decomposition and food webs in marine sediments,” Prog. Mol.
Subcell. Biol., vol. 53, no. 53, pp. 1–13.
8. Bongiorni L., Jain R., Raghukumar S., Aggarwal R. K. (2005) “Thraustochytrium gaertnerium sp. nov.: A new thraustochytrid stramenopilan protist from mangroves of Goa, India,” Protist, vol. 156, no. 3, pp. 303–315.
epiphytic and benthicthraustochytrids involved in organic matter degradation,” Aquat. Microb. Ecol., vol. 41, no. 41, pp. 299–305.
10. Bowles R. D., Hunt A. E., Bremer G. B., Duchars M. G., Eaton R. A. (1999) “Long-chain n - 3 polyunsaturated fatty acid production by members of the marine protistan group the thraustochytrids: screening of isolates and optimisation of docosahexaenoic acid production,” Prog. Ind. Microbiol., vol. 35, no. C, pp. 193–202.
11. Bremer G. B. (1976) “The Ecology of Marine Lower Fungi,” Adv. Aquat.
Mycol., pp. 313–333.
12. Burja A. M., Radianingtyas H., Windust A., Barrow C. J. (2006) “Isolation and characterization of polyunsaturated fatty acid producing Thraustochytrium species: Screening of strains and optimization of omega-3 production,” Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 72, no. 6, pp. 1161–1169. 13. Coleman K., Robie J., June A. (1987) “An epifluorescent microscopy study of
enzymatic hydrolysis of fluorescein diacetate associated with the ectoplasmic net elements of the protist Thraustochytrium striatum,” Can J Microbiol, no. Cmc, pp. 2–4.
14. Dick M. . (1973) “Saprolegniales. In: Ainsworth GC, Sparrow EK, Sussman AS (eds) The fungi: an advanced treatise.,” Acad. Press. New York, vol. 2, p. 62.
15. Facciotti D., Metz J. G., Lassner M. (2000) “Production of polyunsaturated fatty acids by expression of polyketide-like synthesis genes in plants,” 2000. 16. Fan K. W., Vrijmoed L. L. P., Jones E. B. G. (2002) “Physiological Studies of
Subtropical Mangrove Thraustochytrids,” vol. 45, pp. 50–57.
17. Fan K. W., Chen F. (2007) “Production of High-Value Products by Marine Microalgae Thraustochytrids,” Bioprocess. Value-Added Prod. from Renew.
Resour., pp. 293–323.
18. Fawley M., Fawley K. (2004) “a Simple and Rapid Technique for the Isolation of Dna From Microalgae1,” J. Phycol., vol. 225, no. 40, pp. 223–
225.
19. Fell J. W., Newell S. Y. (1998) “Biochemical and molecular methods for the study of marine fungi,” Mol. Approaches to Study Ocean, no. pp, pp. 259– 283.
20. Gaertner A. (1977) “Revision of the Thraustochytriaceae (lower marine fungi). I. Ulkenia nov. gen., with description of three new species.,”
Veröffentlichungen des Institutes für Meeresforsch. Bremerhaven, vol. 16, no.
3, pp. 139–157.
21. Hasegawa M., Kishino H., Yano T. (1985) “Dating the human-ape split by a molecular clock of mitochondrial DNA,” Evolution (N. Y)., vol. 22, no. 2, pp. 160–174.
22. Hauvermale A., Kuner J., Rosenzweig B., Guerra D., Diltz S., et al. (2006) “Fatty acid production in Schizochytrium sp.: Involvement of a polyunsaturated fatty acid synthase and a type I fatty acid synthase,” Lipids, vol. 41, no. 8, pp. 739–747.
23. Honda D., Yokochi T., Nakahara T., Raghukumar S., Nakagiri A., et al. (1999) “Molecular phylogeny of labyrinthulids and thraustochytrids based on the sequencing of 18S ribosomal RNA gene.,” J. Eukaryot. Microbiol., vol. 46, no. 6, pp. 637–647.
24. Hopwood D. A. (1997) “Genetic Contributions to Understanding Polyketide Synthases,” Chem. Rev., vol. 97, no. 7, pp. 2465–2498.
25. Iida I., Nakahara T., Yokochi T., Kamisaka Y., Yagi H., et al. (1996) “Improvement of docosahexaenoic acid production in a culture of Thraustochytrium aureum by medium optimization,” J. Ferment. Bioeng., vol. 81, no. 1, pp. 76–78.
26. Kamlangdee N., Fan K. W. (2003) “Polyunsaturated fatty acids production by Schizochytrium sp . isolated from mangrove,” Songklanakarin J. Sci.
Technol, vol. 25, no. March 2003, pp. 643–650.
protoctists in coastal water,” Mar. Ecol. Prog. Ser., vol. 189, no. Schneider 1977, pp. 27–33.
28. Lambalot R. H., Gehring A. M., Flugel R. S., Zuber P., LaCelle M., et al. (1996) “A new enzyme superfamily — the phosphopantetheinyl transferases,” Chem. Biol., vol. 3, no. 11, pp. 923–936.
29. Leander C. (2001) “Phylogeny of the Labyrinthulomycota,” The University of Georgia, 2001.
30. Lee Chang K. J., Nichols C. M., Blackburn S. I., Dunstan G. A., Koutoulis A., et al. (2014) “Comparison of Thraustochytrids Aurantiochytrium sp., Schizochytrium sp., Thraustochytrium sp., and Ulkenia sp. for Production of Biodiesel, Long-Chain Omega-3 Oils, and Exopolysaccharide,” Mar.
Biotechnol., vol. 16, no. 4, pp. 396–411.
31. Lewin R. A. (1959) “The isolation of algae,” Rev. Algol, no. 3, pp. 181–197. 32. López-García P., Rodriguez-Valera F., Pedrós-Alió C., Moreira D. (2001)
“Unexpected diversity of small eukaryotes in deep-sea Antarctic plankton,”
Nature, vol. 409, no. 6820, pp. 603–607.
33. Metz J. G., Metz J. G., Roessler P., Facciotti D., Levering C., et al. (2001) “Production of Polyunsaturated Fatty Acids by Polyketide Synthases in Both Prokaryotes and Eukaryotes,” Science (80-. )., vol. 290, no. 5528, pp. 290– 293.
34. Moss S. T. (1991) “Thraustochytrids and other zoosporic marine fungi,” “The
Biol. Free. Heterotrophic Flagellates”\nThe Syst. Assoc., vol. Special Vo, no.
Clarendon, Oxford, pp. 415–425.
35. Nagano N., Hayashi M. (2011) “Detection of Genes Involved in Fatty Acid Elongation and Desaturation in Thraustochytrid Marine Eukaryotes,” vol. 481, no. 9, pp. 475–481.
36. Naganuma T., Miura S. (1997) “Abundance, Production and Viability of Bacterioplankton in the Seto Inland Sea, Japan,” J. Oceanogr., vol. 53, no. September 1995, pp. 435–442.
37. Naganuma T., Takasugi H., Kimura H. (1998) “Abundance of thraustochytrids in coastal plankton,” Mar. Ecol. Prog. Ser., vol. 162, no. Raghukumar 1992, pp. 105–110.
38. Nakai R., Naganuma T. (2015) “Marine protists: Diversity and dynamics,” in
Marine Protists: Diversity and Dynamics, 2015, pp. 1–637.
39. Porter D. (1989) “Phylum Labyrinthulomycota In Handbook of protoctista. Margulis L, Corliss JO, Melkonian M, and Chapman D (eds),” Boston, USA
Jones Bartlett Publ., pp. 388–398.
40. Qiu X. (2003) “Biosynthesis of docosahexaenoic acid (DHA, 22:6-4, 7,10,13,16,19): Two distinct pathways,” Prostaglandins Leukot. Essent. Fat.
Acids, vol. 68, no. 2, pp. 181–186.
41. Qiu X., Hong H., MacKenzie S. L. (2001) “Identification of a ??4 Fatty Acid
Desaturase from Thraustochytrium sp. Involved in the Biosynthesis of Docosahexanoic Acid by Heterologous Expression in Saccharomyces cerevisiae and Brassica juncea,” J. Biol. Chem., vol. 276, no. 34, pp. 31561– 31566.
42. Raghukumar S. (2002) “Ecology of the marine protists, the labyrinthulomycetes (thraustochytrids and labyrinthulids),” Eur. J. Protistol., vol. 38, no. 2, pp. 127–145.
43. Raghukumar S. (1988) “Schizochytrium mangrovei sp. nov., a thraustochytrid from mangroves in India,” Trans. Br. Mycol. Soc., vol. 90, pp. 627–631. 44. Raghukumar S. (1980) “Thraustochytrium benthicola sp.nov.: A new marine
fungus from the north sea,” Trans. Br. Mycol. Soc., vol. 74, no. 3, pp. 607–
614.
45. Raghukumar S. (2008) “Thraustochytrid marine protists: Production of PUFAs and other emerging technologies,” Mar. Biotechnol., vol. 10, no. 6, pp. 631–640.
46. Raghukumar S., Damare V. S. (2011) “Increasing evidence for the important role of Labyrinthulomycetes in marine ecosystems,” Bot. Mar., vol. 54, no. 1,
pp. 3–11.
47. Raghukumar S., Schaumann K. (1993) “An epifluorescence microscopy method for direct detection and enumeration of the fungilike marine protists, the thraustochytrids,” Limnol. Ocean., vol. 38, no. 1, pp. 182–187.
48. Ren L. J., Huang H., Xiao A. H., Lian M., Jin L. J., et al. (2009) “Enhanced docosahexaenoic acid production by reinforcing acetyl-CoA and NADPH supply in Schizochytrium sp. HX-308,” Bioprocess Biosyst. Eng., vol. 32, no. 6, pp. 837–843.
49. Sakaguchi K., Matsuda T., Kobayashi T., Ohara J. I., Hamaguchi R., et al. (2012) “Versatile transformation system that is applicable to both multiple transgene expression and gene targeting for thraustochytrids,” Appl. Environ.
Microbiol., vol. 78, no. 9, pp. 3193–3202.
50. Sathe-pathak V., Raghukumar C., Raghukumar S., Sharma S., Chandramohan D. (1994) “Thraustochytrid and fungal component of marine detritus II. Laboratory studies on decomposition of the brown alga Sargassum cinereum J. Ag.,” J. Exp. Mar. Bio. Ecol., vol. 175, no. 2, pp. 227–242.
51. Singh A., Wilson S., Ward O. P. (1996) “Docosahexaenoic acid (DHA) production by Thraustochytrium sp. ATCC 20892,” World J. Microbiol.
Biotechnol., vol. 12, no. 1, pp. 76–81.
52. Sparrow F. K. (1936) “Biological Observations on the Marine Fungi of Woods Hole Waters,” Biol. Bull., vol. 70, no. 2, p. 236.
53. Stokes N. A., Ragone Calvo L. M., Reece K. S., Burreson E. M. (2002) “Molecular diagnostics, field validation, and phylogenetic analysis of Quahog Parasite Unknown (QPX), a pathogen of the hard clam Mercenaria mercenaria,” Dis. Aquat. Organ., vol. 52, no. 3, pp. 233–247.
54. Tran V. T., Braus-Stromeyer S. A., Timpner C., Braus G. H. (May 2013) “Molecular diagnosis to discriminate pathogen and apathogen species of the hybrid Verticillium longisporum on the oilseed crop Brassica napus,” Appl.
55. Voss A., Reinhart M., Sankarappa S., Sprecher H. (1991) “The metabolism of 7,10,13,16,19-docosapentaenoic acid to 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic acid in rat liver is independent of a 4-desaturase,” J. Biol. Chem., vol. 266, no. 30, pp. 19995–20000.
56. Yazawa K. (1996) “Production of eicosapentaenoic acid from marine bacteria,” Lipids, vol. 31, no. 1, pp. S297–S300.
57. Yokochi T., Honda D., Higashihara T., Nakahara T. (1998) “Optimization of docosahexaenoic acid production by Schizochytrium limacinum SR21,” Appl.
Microbiol. Biotechnol., vol. 49, no. 1, pp. 72–76.
58. Yokoyama R., Salleh B., Honda D. (2007) “Taxonomic rearrangement of the genus Ulkenia sensu lato based on morphology, chemotaxonomical characteristics, and 18S rRNA gene phylogeny (Thraustochytriaceae, Labyrinthulomycetes): Emendation for Ulkenia and erection of Botryochytrium, Parietichytrium, ,” Mycoscience, vol. 48, no. 6, pp. 329–341. 59. Yu R., Yamada a, Watanabe K., Yazawa K., Takeyama H., et al. (2000)
“Production of eicosapentaenoic acid by a recombinant marine cyanobacterium, Synechococcus sp.,” Lipids, vol. 35, no. 10, pp. 1061–1064.
Phụ lục
Phụ lục 1. Hình ảnh quan sát mẫu dưới kính lúp Carl Zeiss độphóng đại 6,5x với T (tản) và S (túi bao tử), Thanh kích thước: 10 µm
Phụ lục 2. Sắc đồ từ giải trình tự trực tiếp của các sản phẩm PCR gen 18S rRNA nhân bản từ hệ gen của mười chủng thraustochytrid. Các mũi tên chỉ
Phụ lục 3. Phân tích phát sinh chủng loại của mười chủng thraustochytrid đã phân lập dựa trên phân trình tựDNA đọc được (khoảng 600 bp) của gen 18S