Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện của mRNA IFNγ trước và sau nuôi cấy

Một phần của tài liệu (LUẬN văn THẠC sĩ) nuôi cấy hoạt hóa và đánh giá tính đáp ứng miễn dịch của tế bào lympho gamma delta t (γδt) từ bệnh nhân ung thư phổi (Trang 73 - 100)

STT Mã BN Tr ớc nuôi cấy Sau nuôi cấy ΔΔCt 2-ΔΔCt Ct β-

actin

Ct IFNγ Ct β-actin Ct IFNγ

Mẫu chứng 1 C01 15,2 28,5 15,6 26,8 -2,1 4,28 2 C02 15 28,6 15,5 26,6 -2,5 5,65 3 C03 15,4 28,7 15,7 26,5 -2,5 5,65 4 C04 15,2 28,4 15,9 26,9 -2,2 4,59 5 C05 15,9 28,5 15,4 26,9 -1,1 2,14 6 C06 15,2 28,4 15,4 26,6 -2,0 4.0 7 C07 15,6 28,5 15,8 27 -1,7 3.24

8 C08 15,4 28,1 15,1 26,3 -1,5 2.82 9 C09 15,9 28,9 16,1 26,7 -2,4 5.27 10 C10 15,2 28,5 15,8 26,9 -2,2 4.59 TB 4.22 Mẫu bệnh 11 BN01 16,2 29,6 16,5 28,1 -1,8 3,48 12 BN02 16,4 29,4 16,6 29,7 -1,7 3,24 13 BN03 16,8 29,5 16,5 28,2 -1,0 2,0 14 BN04 16,5 29,6 16,9 28,4 -1,6 3,03 15 BN05 16,2 29,5 16,5 28,1 -1,7 3,24 16 BN06 16,6 28,9 16,3 27,5 -1,1 2,14 17 BN07 16,8 30,2 16,5 29,1 -0,8 1,74 18 BN08 16,4 30,1 16,6 29,5 -0,8 1,74 19 BN09 17 29 17,2 29,7 0,5 0,71 20 BN10 16,5 29,4 16,8 28,3 -1,4 2,64 TB 2,40

Hình 3.10: Mức độ biểu hiện của mRNA IFNγ trên tế bào γδT trước và sau nuôi cấy; *: p < 0,05

Sau 14 ngày ni cấy hoạt hóa, tăng sinh, mức độ biểu hiện của gen IFNγ trên toàn bộ 10 mẫu người khỏe mạnh đều tăng trung bình 4,22 lần so với ngày đầu tiên, cao nhất đạt tới 5,67 lần. Tương tự, ở 9/10 mẫu tế bào sau nuôi cấy của bệnh nhân ung thư phổi cũng quan sát thấy sự tăng biểu hiện của gen IFNγ, trung bình đạt 2,40 lần so với ngày đầu nuôi cấy. Tất cả các kết quả đều có ý nghĩa thống kê với p < 0,05.

Kết quả này cho thấy sau 14 ngày nuôi cấy, tế bào γδT có biểu hiện gen IFNγ tăng rõ rệt so với ngày đầu nuôi cấy.

Để làm rõ hơn khả năng thực hiện chức năng miễn dịch của khối tế bào γδT thu được sau nuôi cấy, kỹ thuật ELISA được thực hiện nhằm đo nồng độ protein IFNγ do khối tế bào γδT tiết ra môi trường nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy tế bào

trong ngày đầu tiên (ngày 0) và ngày thu hoạch (ngày 14) được thu lại để đo nồng độ IFNγ do tế bào γδT tiết ra. Kết quả được nêu trong bảng 3.8 và hình 3.11.

Bảng 3.8: Nồng độ IFNγ trước và sau ni cấy hoạt hóa (pg/ml)

Mẫu chứng Tr ớc ni cấy Sau nuôi cấy

C01 61,83 1793,69 C02 30,80 1417,48 C03 45,45 1717,61 C04 96,62 1929,30 C05 60,00 1501,56 C06 50,23 1547,88 C07 94,52 1625,36 C08 123,20 1526,47 C09 72,56 1758,42 C10 48,96 1685,26 TB 68,42 1650,30

Mẫu bệnh Tr ớc nuôi cấy Sau nuôi cấy

BN01 91,51 1025,36 BN02 62,89 989,69 BN03 42,72 963,25 BN04 110,92 1416,56 BN05 113,27 1962,47 BN06 82,52 1029,58 BN07 74,74 1010,36 BN08 56,52 1002,34 BN09 95,25 1536,49 BN10 62,37 1236,75 TB 79,27 1217,29

Hình 3.11: Nồng độ IFNγ trong môi trường tế bào trước và sau nuôi cấy; *: p < 0.05

Nồng độ IFNγ do tế bào miễn dịch tiết vào môi trường nuôi cấy sau 14 ngày ni cấy hoạt hóa, tăng sinh cao hơn rõ rệt so với ngày đầu, đạt trung bình 1217,29 pg/ml, so với trung bình 79,27 pg/ml trong mơi trường ni cấy của ngày đầu tiên.

Zoledronate có khả năng gây tích lũy Isopentenyl pyrophosphate (IPP), sản phẩm trung gian của con đường mevalonate, dẫn đến hoạt hóa tế bào γδT phụ thuộc thụ thể TCR, gây ra đáp ứng nhanh đối với tế bào chuyển dạng ác tính nội sinh, như tế bào ung thư. Tế bào γδT hoạt hóa sẽ kích thích sự phosphoryl hóa các cấu tử tyrosine trong bào tương trên con đường tín hiệu NF-κB, dẫn đến sự tăng cường biểu hiện của các cytokine. Tăng biểu hiện và khả năng tiết cytokine như IFNγ là một trong những đặc điểm quan trọng của việc đáp ứng sớm này.

Khả năng tiết cytokine của tế bào γδT được đánh giá ở hai mức độ: sự phiên mã của gen IFNγ trong tế bào và khả năng tiết protein IFNγ ra môi trường nuôi cấy tế bào.

Mức độ biểu hiện mRNA IFNγ của tế bào γδT sau nuôi cấy hoạt hóa được đánh giá bằng kỹ thuật PCR định lượng (Realtime PCR).

Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng. Đặc trưng của Real-time PCR là phát hiện sản phẩm khuếch đại trong quá trình chạy PCR khi sản phẩm khuếch đại từ DNA đích được nhân bản đạt đủ số lượng để làm cho ống phản ứng phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích. Chính nhờ đặc trưng này mà có thể biết được số lượng bản DNA đích ban đầu có trong ống phản ứng dựa vào sự xuất hiện huỳnh quang của ống phản ứng sớm hay muộn, tức là chu kỳ ngưỡng (Ct) của ống phản ứng nhỏ hay lớn.

Có hai cách định lượng tác nhân đích: định lượng tuyệt đối và định lượng tương đối. Phương pháp định lượng tuyệt đối đòi hỏi phải biết rõ lượng (thể tích, hay có thể là trọng lượng) của mẫu thử. Phương pháp định lượng tương đối được sử dụng khi người làm thí nghiệm khơng thể cân đo đong đếm được mẫu thử để có được số lượng chính xác. Có thể định lượng tương đối dựa trên đơn vị khối lượng (unitmass), định lượng tuơng đối dựa trên gen nội chuẩn, định lượng tương đối dựa trên khối lượng vật chủ. Do khơng xác định chính xác lượng mRNA ban đầu nên nghiên cứu này sử dụng phương pháp định lượng tương đối dựa trên gen nội chuẩn. Để đánh giá độ chính xác của phương pháp cũng như lượng mRNA đưa vào ban đầu trong các mẫu của phản ứng Real-time PCR, ngoài việc định lượng mRNA của gen đích, gen nội chuẩn β-actin cũng được tiến hành song song. Gen nội chuẩn là một gen luôn biểu hiện ổn định trong tất cả các mơ, tế bào, do đó người ta thường sử dụng gen này để làm đối chứng. Mức độ biểu hiện mRNA của các cytokine được tính tốn dựa vào kết quả Real-time PCR của các gen này và gen β-actin thông qua chu kỳ ngưỡng (Ct). Sử dụng phương pháp 2-Ct của Livak để định lượng tương đối

mức độ phiên mã các gen tại tại 2 thời điểm trước hoạt hóa (12 tiếng sau phân lập) và sau hoạt hóa (ngày 14) [73].

Kết quả phân tích cho thấy sau 14 ngày ni cấy hoạt hóa, tăng sinh, mức độ biểu hiện gen IFNγ ở mức độ mRNA tăng đáng kể so với ngày đầu nuôi cấy. Cụ thể, ở tế bào nuôi cấy từ bệnh nhân ung thư phổi, biểu hiện gen IFNγ tăng trung bình 2,40 lần, trong khi ở tế bào nuôi cấy từ người tình nguyện khỏe mạnh, biểu hiện gen IFNγ tăng trung bình 4,22 lần. Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Kondo và cs (2011), nhận thấy biểu hiện gen IFNγ tăng mạnh trong tế bào γδT sau nuôi cấy [60].

Để đánh giá khả năng tiết protein IFN ra môi trường nuôi cấy của các tế bào miễn dịch trị liệu, kỹ thuật ELISA được sử dụng trong nghiên cứu của chúng tôi. Đây là kỹ thuật cho phép xác định nồng độ protein IFN trong môi trường nuôi cấy. Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý của phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể, đồng thời sử dụng kháng thể gắn enzym và chất phát triển màu mà qua đó chúng ta có thể phát hiện được nồng độ của protein cần biết trong mẫu phân tích, ở đây chính là mơi trường ni cấy tế bào miễn dịch.

Kết quả định lượng IFNγ tiết ra môi trường nuôi cấy bởi tế bào γδT sau 14 ngày ni cấy cho thấy có sự tăng cường tiết IFNγ của tế bào γδT sau khi được hoạt hóa. Sau ni cấy, nồng độ IFNγ trong mơi trường ni cấy trung bình là 1650,30 pg/ml ở người tình nguyện khỏe mạnh và 1217,29 pg/ml ở bệnh nhân ung thư phổi, cao hơn nhiều so với nồng độ IFNγ có trong mơi trường ni cấy khi tế bào γδT chưa hoạt hóa (68,42 pg/ml ở người tình nguyện khỏe mạnh và 79,27 pg/ml ở bệnh nhân ung thư phổi).

3.4.2. Hoạt tín ây độc cho tế bào của tế bào γδT sau ni cấy

Hoạt tính gây độc cho tế bào ung thư H460 của tế bào γδT sau 14 ngày nuôi cấy được thực hiện trên hệ thống Terascan VPC. Tế bào γδT thu được từ người tình nguyện khỏe mạnh thể hiện độc tính khá cao với dịng tế bào ung thư phổi H460, đạt 42,6% ở tỷ lệ E/T 10:1 và 51,7% ở tỷ lệ E/T 30:1. Như thể hiện trong hình 3.12, tế bào γδT từ bệnh nhân ung thư phổi cũng thể hiện độc tính tương tự với dịng tế

bào H460, đạt 38,8% ở tỷ lệ E/T 10:1 và 43,7% ở tỷ lệ E/T 30:1. Khơng có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa độc tính đối với dịng tế bào ung thư H460 của tế bào γδT sau nuôi cấy hoạt hóa tăng sinh thu từ người tình nguyện khỏe mạnh và bệnh nhân ung thư phổi.

Hình 3.12: Hoạt tính gây độc tế bào của tế bào lympho γδT sau 14 ngày ni cấy. Hoạt tính này được đo bằng tỷ lệ tế bào ung thư đích (H460) bị ly giải với các tỷ

lệ E/T lần lượt là 1:1, 10:1, 30:1.

Tế bào γδT sau hoạt hóa có khả năng trực tiếp ly giải tế bào ung thư thông qua tiết một số enzyme ly giải tế bào như perforin và granzyme [131]. Tế bào γδT sau hoạt hóa có thể loại bỏ các tế bào ung thư thông qua các thụ thể TRAIL và FasL, kích hoạt q trình chết theo chương trình của tế bào ung thư [86]. Để kiểm tra khả năng gây độc của tế bào γδT sau nuôi cấy hoạt hóa, tăng sinh, chúng tơi đã sử dụng phương pháp đo độc tính tế bào [2]. Kết quả cho thấy tế bào γδT sau ni cấy có khả năng ly giải tế bào ung thư khi số lượng tế bào miễn dịch γδT nhiều hơn số lượng tế bào ung thư từ 10 lần trở lên. Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Kondo và cộng sự khi nghiên cứu hoạt hóa, tăng sinh số lượng lớn tế bào γδT [61].

KẾT LUẬN

1. Xây dựng quy trình phân lập và ni cấy hoạt óa, tăn sin tế bào γδT

- Chuẩn hóa quy trình phân lập, ni cấy hoạt hóa, tăng sinh số lượng lớn tế bào miễn dịch γδT, sử dụng zoledronate và IL-2 với nồng độ tương ứng là 5 mM và 600 IU/ml.

- Áp dụng điều kiện ni cấy hoạt hóa, tăng sinh đã được chuẩn hóa để nuôi cấy tăng sinh số lượng lớn, thu được quần thể tế bào γδT được làm giàu chiếm đa số.

2 Đán iá tín đáp ứng miễn dịch của tế bào γδT tác từ bện n ân un t phổi đã oạt hóa

- Có sự tăng cường biểu hiện ở mức độ mRNA của gen IFNγ ở tế bào γδT sau khi được ni cấy hoạt hóa, tăng sinh.

- Khơng chỉ ở mức độ mRNA, có sự tăng cường tiết cytokine IFNγ của tế bào γδT sau khi được hoạt hóa, tăng sinh

- Tế bào γδT sau ni cấy hoạt hóa thể hiện được độc tính đối với dịng tế bào ung thư phổi H460 khi đồng nuôi cấy với tỷ lệ tế bào miễn dịch : tế bào ung thư là 10: 1.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Adams EJ, Havran WL. Introduction to Cellular Immunology Special Issue on γδ T cells. Cell Immunol. 2015;296(1):1-2. doi:10.1016/j.cellimm.2015.06.001.

2. Adan A, Kiraz Y, Baran Y. Cell Proliferation and Cytotoxicity Assays. Curr

Pharm Biotechnol. 2016;17(14):1213-1221.

3. Akaza H, Tsukamoto T, Fujioka T, et al. Combined immunotherapy with low- dose IL-2 plus IFN-alpha for metastatic renal cell carcinoma: survival benefit for selected patients with lung metastasis and serum sodium level. Jpn J Clin

Oncol. 2011;41(8):1023-1030. doi:10.1093/jjco/hyr067.

4. Alberg AJ, Brock MV, Ford JG, Samet JM, Spivack SD. Epidemiology of lung cancer: Diagnosis and management of lung cancer, 3rd ed: American College of Chest Physicians evidence-based clinical practice guidelines.

Chest. 2013;143(5 Suppl):e1S-e29S. doi:10.1378/chest.12-2345.

5. Andtbacka RHI, Kaufman HL, Collichio F, et al. Talimogene Laherparepvec Improves Durable Response Rate in Patients With Advanced Melanoma. J Clin Oncol Off J Am Soc Clin Oncol. 2015;33(25):2780-2788.

doi:10.1200/JCO.2014.58.3377.

6. Atkins MB. Interleukin-2: clinical applications. Semin Oncol. 2002;29(3

Suppl 7):12-17.

7. Banchereau J, Steinman RM. Dendritic cells and the control of immunity.

8. Barkholt L, Alici E, Conrad R, et al. Safety analysis of ex vivo-expanded NK and NK-like T cells administered to cancer patients: a phase I clinical study.

Immunotherapy. 2009;1(5):753-764. doi:10.2217/imt.09.47.

9. Belardelli F, Ferrantini M, Proietti E, Kirkwood JM. Interferon-alpha in tumor immunity and immunotherapy. Cytokine Growth Factor Rev. 2002;13(2):119- 134. doi:10.1016/s1359-6101(01)00022-3.

10. Bonneville M, O’Brien RL, Born WK. γδ T cell effector functions: a blend of innate programming and acquired plasticity. Nat Rev Immunol. 2010;10:467. 11. Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. Global

cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. doi:10.3322/caac.21492.

12. Burjanadzé M, Condomines M, Reme T, et al. In vitro expansion of gamma delta T cells with anti-myeloma cell activity by Phosphostim and IL-2 in patients with multiple myeloma. Br J Haematol. 2007;139(2):206-216.

doi:10.1111/j.1365-2141.2007.06754.x.

13. de Chaisemartin L, Goc J, Damotte D, et al. Characterization of chemokines and adhesion molecules associated with T cell presence in tertiary lymphoid structures in human lung cancer. Cancer Res. 2011;71(20):6391-6399.

doi:10.1158/0008-5472.CAN-11-0952.

14. Cheng M, Chen Y, Xiao W, Sun R, Tian Z. NK cell-based immunotherapy for malignant diseases. Cell Mol Immunol. 2013;10(3):230-252. doi:10.1038/cmi.2013.10.

15. Chien Y, Konigshofer Y. Antigen recognition by gammadelta T cells.

16. Chien Y, Meyer C, Bonneville M. γδ T cells: first line of defense and beyond.

Annu Rev Immunol. 2014;32:121-155. doi:10.1146/annurev-immunol-

032713-120216.

17. Chiplunkar S, Dhar S, Wesch D, Kabelitz D. gammadelta T cells in cancer immunotherapy: current status and future prospects. Immunotherapy.

2009;1(4):663-678. doi:10.2217/imt.09.27.

18. Choi HS, Ha SY, Kim H-M, et al. The prognostic effects of tumor infiltrating regulatory T cells and myeloid derived suppressor cells assessed by multicolor flow cytometry in gastric cancer patients. Oncotarget.

2016;7(7):7940-7951. doi:10.18632/oncotarget.6958.

19. Corkum CP, Ings DP, Burgess C, Karwowska S, Kroll W, Michalak TI. Immune cell subsets and their gene expression profiles from human PBMC isolated by Vacutainer Cell Preparation Tube (CPTTM) and standard density gradient. BMC Immunol. 2015;16:48. doi:10.1186/s12865-015-0113-0.

20. Cornish GH, Sinclair LV, Cantrell DA. Differential regulation of T-cell growth by IL-2 and IL-15. Blood. 2006;108(2):600-608. doi:10.1182/blood-

2005-12-4827.

21. Dagur PK, McCoy JP. Collection, Storage, and Preparation of Human Blood Cells. Curr Protoc Cytom Editor Board J Paul Robinson Manag Ed Al.

2015;73:5.1.1-5.1.16. doi:10.1002/0471142956.cy0501s73.

22. Davies JOJ, Stringaris K, Barrett AJ, Rezvani K. Opportunities and limitations of natural killer cells as adoptive therapy for malignant disease.

Cytotherapy. 2014;16(11):1453-1466. doi:10.1016/j.jcyt.2014.03.009.

23. Davis MR, Zhu Z, Hansen DM, Bai Q, Fang Y. The role of IL-21 in immunity and cancer. Cancer Lett. 2015;358(2):107-114. doi:10.1016/j.canlet.2014.12.047.

24. Deenick EK, Gett AV, Hodgkin PD. Stochastic model of T cell proliferation: a calculus revealing IL-2 regulation of precursor frequencies, cell cycle time, and survival. J Immunol Baltim Md 1950. 2003;170(10):4963-4972.

doi:10.4049/jimmunol.170.10.4963.

25. Denman CJ, Senyukov VV, Somanchi SS, et al. Membrane-bound IL-21 promotes sustained ex vivo proliferation of human natural killer cells. PloS One. 2012;7(1):e30264. doi:10.1371/journal.pone.0030264.

26. Dieu-Nosjean M-C, Antoine M, Danel C, et al. Long-term survival for patients with non-small-cell lung cancer with intratumoral lymphoid structures. J Clin Oncol Off J Am Soc Clin Oncol. 2008;26(27):4410-4417.

doi:10.1200/JCO.2007.15.0284.

27. Dokouhaki P, Han M, Joe B, et al. Adoptive immunotherapy of cancer using ex vivo expanded human gammadelta T cells: A new approach. Cancer Lett. 2010;297(1):126-136. doi:10.1016/j.canlet.2010.05.005.

28. van Dongen JJM, Langerak AW, Brüggemann M, et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4- CT98-3936. Leukemia. 2003;17(12):2257-2317. doi:10.1038/sj.leu.2403202. 29. Dranoff G. GM-CSF-secreting melanoma vaccines. Oncogene.

2003;22(20):3188-3192. doi:10.1038/sj.onc.1206459.

30. Dunkelberger JR, Song W-C. Complement and its role in innate and adaptive immune responses. Cell Res. 2010;20(1):34-50. doi:10.1038/cr.2009.139. 31. Dunn GP, Bruce AT, Ikeda H, Old LJ, Schreiber RD. Cancer immunoediting:

Một phần của tài liệu (LUẬN văn THẠC sĩ) nuôi cấy hoạt hóa và đánh giá tính đáp ứng miễn dịch của tế bào lympho gamma delta t (γδt) từ bệnh nhân ung thư phổi (Trang 73 - 100)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(100 trang)