Code Số lượng
(trước nuôi cấy)
Tỷ lệ sống Số lượng (sau nuôi cấy)
Tỷ lệ sống BN01 1,5 x 104 95% 1,5 x 108 91% BN02 1,8 x 104 94% 4,5 x 108 89% BN03 1,9 x 104 96% 1,1 x 108 92% BN04 1,2 x 104 95% 1,6 x 108 93% BN05 1,4 x 104 90% 4,8 x 108 97% BN06 2,4 x 104 98% 2,5 x 108 96% BN07 2,6 x 104 95% 2,8 x 108 90% BN08 1,9 x 104 92% 3,7 x 108 78% BN09 2,2 x 104 96% 3,2 x 108 90% BN10 2,7 x 104 97% 3,6 x 108 90% TB 1,96 x 104 94,8% 2,93 x 108 90,6%
Một số hình ảnh tế bào của bệnh nhân ung thư phổi tại ngày 0 và ngày 14 được minh họa trong hình 3.6 và hình 3.7. Số lượng tế bào miễn dịch thu được tăng khoảng 1500 lần sau 14 ngày nuôi cấy, đạt giá trị khoảng 2,93 x 108 tế bào, tỷ lệ sống đạt trên 90,6%. Kết quả phù hợp với yêu cầu của khối tế bào miễn dịch cần đạt sau 14 ngày ni cấy
Hình 3.6: Hình ảnh tế bào của bệnh nhân ung thư BN01 trước và sau nuôi cấ.
A. Hình ảnh và số lượng tế bào thu được trước ni cấy; B. Hình ảnh và số lượng tế bào thu được sau nuôi cấy
A B
Hình 3.7: Hình ảnh tế bào của bệnh nhân ung thư BN05 trước và sau ni cấy.
A. Hình ảnh và số lượng tế bào thu được trước ni cấy; B. Hình ảnh và số lượng tế bào thu được sau nuôi cấy
3 3 Xác định tỷ lệ tế bào γδT tron quần thể tế bào t u đ ợc sau nuôi cấy
Bằng kỹ thuật đếm dòng chảy tế bào (Flow cytometry), tỷ lệ tế bào γδT có thể được xác định bằng cách nhuộm với kháng thể kháng CD3, CD8, CD4. Quần thể tế bào γδT sẽ biểu hiện CD3+/CD8-/CD4- trên bề mặt tế bào. Từ đó chúng ta có thể xác định được tỷ lệ của tế bào γδT trong quần thể tế bào thu được trước và sau nuôi cấy.
A B
3 3 Xác định tỷ lệ tế bào γδT tron quần thể tế bào sau nuôi cấy của n ời khỏe mạnh
Mười mẫu tế bào người khỏe mạnh trước và sau nuôi cấy được xác định tỷ lệ tế bào γδT trong quần thể tế bào bằng kỹ thuật đếm dòng chảy tế bào (Flow cytometry). Kết quả được trình bày trong bảng 3.5 và minh họa trong hình 3.8.
Bảng 3.5: Tỷ lệ tế bào γδT của người tình nguyện khỏe mạnh trước và sau ni cấy
Mẫu Tỷ lệ tế bào γδT (%)
Tr ớc nuôi cấy Sau nuôi cấy
C01 5,8% 78% C02 6,3% 76% C03 4,15% 79% C04 5,73% 71% C05 5,5% 77% C06 6,65% 82% C07 5,1% 83% C08 5,12% 79% C09 7,5% 85% C10 6,8% 84%
Hình 3.8: Kết quả đếm dịng chảy tế bào xác định tỷ lệ tế bào γδT mẫu C02
A. Hình ảnh đếm dịng chảy tế bào trước ni cấy; B. Hình ảnh đếm dịng chảy tế bào sau nuôi cấy;
Các mẫu tế bào của người khỏe mạnh trước ni cấy có tỷ lệ tế bào γδT khoảng 5-7%. Số liệu này phù hợp với tỷ lệ tế bào γδT có trong máu ngoại vi của cơ thể. Sau 14 ngày nuôi cấy, ở tất cả các mẫu ni cấy đều có tỷ lệ tế bào γδT đạt trên 79,4% (Hình 3.8A và B). Biểu hiện của gene mã hóa cho thụ thể bề mặt Vγ9 - thụ thể đặc trưng cho tế bào γδT cũng cho thấy gen Vγ9 biểu hiện mạnh ở tế bào γδT sau nuôi cấy, gần như khơng biểu hiện trên dịng tế bào αβT sau ni cấy hoạt hóa, tăng sinh (Hình 3.8C). Kết quả này cho thấy các mẫu người khỏe mạnh đáp ứng tốt với điều kiện ni cấy hoạt hóa tế bào γδT.
Máu ngoại vi của người tình nguyện khỏe mạnh được thu thập và phân lập tế bào miễn dịch. Sau khi phân lập, số lượng tế bào miễn dịch thu được đạt trung bình 5 x 106 tế bào, tỷ lệ sống đạt trung bình 94%, trong đó tỷ lệ tế bào γδT chiếm 6%. Kết quả này tương đồng với các nghiên cứu đã công bố trước đây.
Tế bào miễn dịch sau phân lập được ni cấy trong mơi trường có bổ sung 5 mM zoledronate và 600 IU/ml IL-2 để hoạt hóa, tăng sinh tế bào γδT. Sau 15 ngày nuôi cấy, số lượng tế bào thu được đạt 3,0 x 108, tỷ lệ sống trung bình 93,7%, trong đó, tế bào γδT chiếm trung bình 80%. Kết quả này cho thấy, số lượng tế bào γδT đã tăng sinh gấp 1500 lần so với ngày đầu ni cấy. Kết quả này có cao hơn khá rõ rệt so với những nghiên cứu trước đây khi nuôi cấy tăng sinh tế bào γδT, sử dụng biphosphonate và cytokine [117]. Sự khác biệt này có thể xảy ra do có sự khác nhau trong việc sử dụng biphosphonate khác nhau cũng như nồng độ của cytokine được sử dụng trong nghiên cứu.
Trong quần thể tế bào thu được gần như hoàn toàn là tế bào lympho T, đặc biệt là tế bào γδT. Tế bào T độc và T trợ giúp chỉ chiếm khoảng 10 - 15%, tế bào NK chỉ chiếm một tỷ lệ nhỏ (5,9%) và hoàn tồn khơng thấy sự xuất hiện của tế bào lympho B trong quần thể tế bào sau 14 ngày ni cấy bằng mơi trường có bổ sung zoledronate và IL-2. Kết quả này chứng tỏ điều kiện nuôi cấy, hoạt hóa, tăng sinh tế bào γδT từ máu ngoại vi đã được chuẩn hóa tốt.
3 3 2 Xác định tỷ lệ tế bào γδT tron quần thể tế bào sau nuôi cấy của bệnh n ân un t phổi
Mười mẫu tế bào bệnh nhân ung thư phổi trước và sau nuôi cấy xác định tỷ lệ tế bào γδT trong quần thể tế bào bằng kỹ thuật đếm dòng chảy tế bào (Flow cytometry). Kết quả được trình bày trong bảng 3.6 và minh họa trong hình 3.9.
Bảng 3.6: Tỷ lệ tế bào γδT của bệnh nhân ung thư phổi trước và sau nuôi cấy
Mẫu Tỷ lệ tế bào γδT
Tr ớc nuôi cấy Sau nuôi cấy
BN01 5,1% 81% BN02 6,2% 83% BN03 5% 86% BN04 6,3% 87% BN05 6,4% 84% BN06 6,2% 82% BN07 6,1% 83% BN08 5,8% 80% BN09 6,5% 85% BN10 5,8% 81%
Hình 3.9: Kết quả đếm dòng chảy tế bào xác định tỷ lệ tế bào γδT mẫu BN06
A. Hình ảnh đếm dịng chảy tế bào trước ni cấy; B. Hình ảnh đếm dịng chảy tế bào sau ni cấy;
Các mẫu tế bào của bệnh nhân ung thư phổi trước ni cấy có tỷ lệ tế bào γδT khoảng 5-7%. Số liệu này phù hợp với tỷ lệ tế bào γδT có trong máu ngoại vi của cơ thể. Sau 14 ngày nuôi cấy, ở tất cả các mẫu ni cấy đều có tỷ lệ tế bào γδT đạt trên 80%, trung bình đạt 83,2% (Hình 3.9A và B). Biểu hiện của gene mã hóa cho thụ thể bề mặt Vγ9 - thụ thể đặc trưng cho tế bào γδT cũng cho thấy gen Vγ9 biểu hiện mạnh ở tế bào γδT sau ni cấy, gần như khơng biểu hiện trên dịng tế bào αβT sau ni cấy hoạt hóa, tăng sinh (Hình 3.9C) Kết quả này cho thấy các mẫu bệnh nhân ung thư đáp ứng rất tốt với điều kiện ni cấy hoạt hóa, tăng sinh tế bào γδT.
Với những kết quả thu được trên mẫu người tình nguyện, quy trình phân lập, ni cấy hoạt hóa, tăng sinh tế bào lympho từ máu ngoại vi được áp dụng trên bệnh nhân phổi.
Số lượng tế bào bạch cầu tách được từ 10 ml máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư phổi trung bình là 1,96 x 104, tương đương với nhóm người tình nguyện.
Điều này được giải thích do tất cả các bệnh nhân trong nghiên cứu đều đang trong giai đoạn bệnh ổn định và chưa hoặc dừng điều trị bằng phóng xạ hay hóa chất. Tất cả các mẫu đều đạt tỷ lệ sống của tế bào trên 90%, trung bình 94,8%. Kết quả trên tương đồng với những nghiên cứu tăng sinh hoạt hóa tế bào γδT sử dụng biphosphonate kết hợp với cytokine đã được công bố trước đây. Burjanadze M. và cộng sự (2007) sử dụng phosphotism hoặc zoldronate kết hợp với IL-2 để ni cấy hoạt hóa và tăng sinh γδT trên bệnh nhân u tủy. Sau 14 ngày nuôi cấy, 88% tế bào thu được là γδT, số lượng tế bào γδT đạt 2,5 x 106
tế bào, mức độ tăng sinh gấp 300 lần so với ngày đầu nuôi cấy [12]. Tương tự với nghiên cứu này, Kondo và cs (2011) cũng sử dụng 5 mM zoledronate và 1000 IU/ml IL-2, thu được 93,8% tế bào γδT trong quần thể tế bào thu được, sau 14 ngày nuôi cấy, với số lượng tế bào thu được 2,2 x 108 tế bào, tăng 1375 lần so với ngày đầu nuôi cấy [60]. Yoshimasa T. và cs (2018) đã sử dụng PTA thay cho zoledronate để hoạt hóa, tăng sinh tế bào γδT trên tế bào ung thư vú và ung thư tuyến tiền liệt. Kết quả cho thấy sử dụng PTA, thu được số lượng tế bào đạt 5,6 x 108 tế bào, trong đó 95,6% là tế bào γδT, tăng gấp 7085 lần so với ngày đầu nuôi cấy [119]. So sánh với các nghiên cứu tương tự trên
thế giới cho thấy quy trình phân lập, hoạt hóa tăng sinh tế bào γδT áp dụng trong nghiên cứu này có hiệu quả tương đương và chất lượng đảm bảo để thực hiện những nghiên cứu tiếp theo.
3 4 Đán iá mức độ hoạt hóa và hoạt tính của tế bào miễn dịc γδT sau nuôi cấy cấy
Mức độ hoạt hóa của tế bào miễn dịch γδT được đánh giá thông qua khả năng tiết các cytokine như IFNγ, TNFα cũng như khả năng gây độc cho tế bào ung thư. Khả năng tiết cytokine của tế bào được xác định bằng kỹ thuật Realtime PCR (với mức độ mRNA) và ELISA (với mức độ protein). Trong khi đó, khả năng gây độc cho tế bào ung thư của tế bào γδT sẽ được xác định bằng phương pháp đo hoạt tính gây độc cho tế bào.
3.4.1. Khả năn tiết IFNγ của tế bào γδT vào môi tr ờng nuôi cấy sau hoạt óa, tăn sin
Ở mức độ RNA, biểu hiện của mRNA IFNγ được xác định bằng kỹ thuật Realtime PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen IFNγ. Kết quả được đưa ra trong bảng 3.7 và hình 3.10.
Bảng 3.7: Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện của mRNA IFNγ trước và sau nuôi cấy
STT Mã BN Tr ớc nuôi cấy Sau nuôi cấy ΔΔCt 2-ΔΔCt Ct β-
actin
Ct IFNγ Ct β-actin Ct IFNγ
Mẫu chứng 1 C01 15,2 28,5 15,6 26,8 -2,1 4,28 2 C02 15 28,6 15,5 26,6 -2,5 5,65 3 C03 15,4 28,7 15,7 26,5 -2,5 5,65 4 C04 15,2 28,4 15,9 26,9 -2,2 4,59 5 C05 15,9 28,5 15,4 26,9 -1,1 2,14 6 C06 15,2 28,4 15,4 26,6 -2,0 4.0 7 C07 15,6 28,5 15,8 27 -1,7 3.24
8 C08 15,4 28,1 15,1 26,3 -1,5 2.82 9 C09 15,9 28,9 16,1 26,7 -2,4 5.27 10 C10 15,2 28,5 15,8 26,9 -2,2 4.59 TB 4.22 Mẫu bệnh 11 BN01 16,2 29,6 16,5 28,1 -1,8 3,48 12 BN02 16,4 29,4 16,6 29,7 -1,7 3,24 13 BN03 16,8 29,5 16,5 28,2 -1,0 2,0 14 BN04 16,5 29,6 16,9 28,4 -1,6 3,03 15 BN05 16,2 29,5 16,5 28,1 -1,7 3,24 16 BN06 16,6 28,9 16,3 27,5 -1,1 2,14 17 BN07 16,8 30,2 16,5 29,1 -0,8 1,74 18 BN08 16,4 30,1 16,6 29,5 -0,8 1,74 19 BN09 17 29 17,2 29,7 0,5 0,71 20 BN10 16,5 29,4 16,8 28,3 -1,4 2,64 TB 2,40
Hình 3.10: Mức độ biểu hiện của mRNA IFNγ trên tế bào γδT trước và sau nuôi cấy; *: p < 0,05
Sau 14 ngày ni cấy hoạt hóa, tăng sinh, mức độ biểu hiện của gen IFNγ trên toàn bộ 10 mẫu người khỏe mạnh đều tăng trung bình 4,22 lần so với ngày đầu tiên, cao nhất đạt tới 5,67 lần. Tương tự, ở 9/10 mẫu tế bào sau nuôi cấy của bệnh nhân ung thư phổi cũng quan sát thấy sự tăng biểu hiện của gen IFNγ, trung bình đạt 2,40 lần so với ngày đầu nuôi cấy. Tất cả các kết quả đều có ý nghĩa thống kê với p < 0,05.
Kết quả này cho thấy sau 14 ngày ni cấy, tế bào γδT có biểu hiện gen IFNγ tăng rõ rệt so với ngày đầu nuôi cấy.
Để làm rõ hơn khả năng thực hiện chức năng miễn dịch của khối tế bào γδT thu được sau nuôi cấy, kỹ thuật ELISA được thực hiện nhằm đo nồng độ protein IFNγ do khối tế bào γδT tiết ra môi trường nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy tế bào
trong ngày đầu tiên (ngày 0) và ngày thu hoạch (ngày 14) được thu lại để đo nồng độ IFNγ do tế bào γδT tiết ra. Kết quả được nêu trong bảng 3.8 và hình 3.11.
Bảng 3.8: Nồng độ IFNγ trước và sau ni cấy hoạt hóa (pg/ml)
Mẫu chứng Tr ớc nuôi cấy Sau nuôi cấy
C01 61,83 1793,69 C02 30,80 1417,48 C03 45,45 1717,61 C04 96,62 1929,30 C05 60,00 1501,56 C06 50,23 1547,88 C07 94,52 1625,36 C08 123,20 1526,47 C09 72,56 1758,42 C10 48,96 1685,26 TB 68,42 1650,30
Mẫu bệnh Tr ớc nuôi cấy Sau nuôi cấy
BN01 91,51 1025,36 BN02 62,89 989,69 BN03 42,72 963,25 BN04 110,92 1416,56 BN05 113,27 1962,47 BN06 82,52 1029,58 BN07 74,74 1010,36 BN08 56,52 1002,34 BN09 95,25 1536,49 BN10 62,37 1236,75 TB 79,27 1217,29
Hình 3.11: Nồng độ IFNγ trong môi trường tế bào trước và sau nuôi cấy; *: p < 0.05
Nồng độ IFNγ do tế bào miễn dịch tiết vào môi trường nuôi cấy sau 14 ngày ni cấy hoạt hóa, tăng sinh cao hơn rõ rệt so với ngày đầu, đạt trung bình 1217,29 pg/ml, so với trung bình 79,27 pg/ml trong môi trường nuôi cấy của ngày đầu tiên.
Zoledronate có khả năng gây tích lũy Isopentenyl pyrophosphate (IPP), sản phẩm trung gian của con đường mevalonate, dẫn đến hoạt hóa tế bào γδT phụ thuộc thụ thể TCR, gây ra đáp ứng nhanh đối với tế bào chuyển dạng ác tính nội sinh, như tế bào ung thư. Tế bào γδT hoạt hóa sẽ kích thích sự phosphoryl hóa các cấu tử tyrosine trong bào tương trên con đường tín hiệu NF-κB, dẫn đến sự tăng cường biểu hiện của các cytokine. Tăng biểu hiện và khả năng tiết cytokine như IFNγ là một trong những đặc điểm quan trọng của việc đáp ứng sớm này.
Khả năng tiết cytokine của tế bào γδT được đánh giá ở hai mức độ: sự phiên mã của gen IFNγ trong tế bào và khả năng tiết protein IFNγ ra môi trường nuôi cấy tế bào.
Mức độ biểu hiện mRNA IFNγ của tế bào γδT sau ni cấy hoạt hóa được đánh giá bằng kỹ thuật PCR định lượng (Realtime PCR).
Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng. Đặc trưng của Real-time PCR là phát hiện sản phẩm khuếch đại trong quá trình chạy PCR khi sản phẩm khuếch đại từ DNA đích được nhân bản đạt đủ số lượng để làm cho ống phản ứng phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích. Chính nhờ đặc trưng này mà có thể biết được số lượng bản DNA đích ban đầu có trong ống phản ứng dựa vào sự xuất hiện huỳnh quang của ống phản ứng sớm hay muộn, tức là chu kỳ ngưỡng (Ct) của ống phản ứng nhỏ hay lớn.
Có hai cách định lượng tác nhân đích: định lượng tuyệt đối và định lượng tương đối. Phương pháp định lượng tuyệt đối địi hỏi phải biết rõ lượng (thể tích, hay có thể là trọng lượng) của mẫu thử. Phương pháp định lượng tương đối được sử dụng khi người làm thí nghiệm khơng thể cân đo đong đếm được mẫu thử để có được số lượng chính xác. Có thể định lượng tương đối dựa trên đơn vị khối lượng (unitmass), định lượng tuơng đối dựa trên gen nội chuẩn, định lượng tương đối dựa trên khối lượng vật chủ. Do khơng xác định chính xác lượng mRNA ban đầu nên nghiên cứu này sử dụng phương pháp định lượng tương đối dựa trên gen nội chuẩn. Để đánh giá độ chính xác của phương pháp cũng như lượng mRNA đưa vào ban đầu trong các mẫu của phản ứng Real-time PCR, ngoài việc định lượng mRNA của gen đích, gen nội chuẩn β-actin cũng được tiến hành song song. Gen nội chuẩn là