Chƣơng 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp
2.2.9. Tách chiết DNA plasmid
Cơ sở lý thuyết
Phương pháp tách chiết DNA plasmid dựa trên nguyên lý sử dụng các hóa chất (SDS, NaOH) có tác dụng phá vỡ cấu trúc thành tế bào vi khuẩn, biến tính các phân tử protein và giải phóng các plasmid của vi khuẩn. Khi thay đổi giá trị pH của dịch chiết tế bào bằng dung dịch có chứa kali-acetat, các phân tử protein và DNA hệ gen sẽ bị tủa, tách ra khỏi dung dịch bằng ly tâm tốc độ cao. RNA được loại bỏ bằng cách bổ sung RNase.
Quy trình
Cấy chuyển 1khuẩn lạc của tế bào E.coli mang plasmid cần tách vào trong
ống nghiệm chứa 1,7 ml mơi trường LB có bổ sung Amp (100 µg/ml), ni lắc qua đêm ở 370C, 200 vịng/phút.
Chuyển 1,5 ml dịch ni cấy vào ống eppendorf loại 1,5 ml, ly tâm 6 phút tốc độ 7.000 vòng/phút. Loại bỏ dịch nổi thu tế bào.
Hòa đều tế bào thu được với 150 µl dung dịch Sol I bằng máy vortex, để trên đá 5 phút.
Bổ sung 200 µl dung dịch Sol II, đảo đầu ống eppendorf nhanh, nhẹ nhàng để tránh đứt gẫy DNA, ủ trên đá 5 phút.
Bổ sung tiếp 150 µl dung dịch Sol III và đảo nhẹ 5 lần, trong hỗn hợp sẽ xuất hiện kết tủa trắng, ủ trong đá 5 phút.
Ly tâm 15 phút với tốc độ 12.000 vòng/phút, 40
C.
Thu dịch nổi và chuyển sang ống eppendorf mới. Bổ sung 500 µl dung dịch phenol/chloroform, trộn thật đều và ly tâm 15 phút, tốc độ 12.000 vòng/phút.
Hút pha trên chuyển sang ống eppendorf và lặp lại bước trên với 450 µl hỗn hợp chloroform: isoamyl alcohol (24:1).
Tủa dịch pha trên với 2,5 lần thể tích ethanol 100%, thêm dung dịch muối natri acetate (pH 5,2) tới nồng độ cuối cùng là 0,3 M. Để dung dịch kết tủa ở -200C
Thu DNA kết tủa bằng cách ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút. Phần tủa DNA được rửa 2 lần với ethanol 70%, mỗi lần 1 ml và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút.
Tủa DNA được làm khơ bằng máy Speed-Vac, hịa tan DNA plasmid bằng 50 µl H2O có chứa RNase nồng độ cuối cùng là 10 µg/ml, ủ hỗn hợp ở 370C trong thời gian 30 phút.
Điện di kiểm tra DNA plasmid trên gel agarose 0,8%.