Chƣơng 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.7. Chủng biểu hiện E.coli BL21(DE3)
E. coli BL21 là chủng được bắt nguồn từ E. coli B, được phát hiện vào năm
1946. E. coli là vi khuẩn Gram âm, kị khí tùy tiện và khơng sinh bào tử. Chúng có bộ máy di truyền tương đối đơn giản, thành phần di truyền sơ cấp chỉ là một nhiễm sắc thể đơn với kích thước khoảng 5,44 x 106
cặp base. Tế bào E. coli có khả năng sinh sản với tốc độ nhanh trên mơi trường ni cấy tối thiểu, trung bình khoảng 20 phút chúng lại phân chia một lần. Đặc biệt, chúng có khả năng thu nhận rất nhiều yếu tố di truyền từ mơi trường ngồi như plasmid, phage... Ngồi ra, chúng có khả
một vật chủ hữu hiệu trong kĩ thuật tách dòng cũng như trong kỹ thuật biểu hiện gen [ 7], [10].
Chủng biểu hiện E. coli BL21(DE3) được cải biến từ E. coli BL21, chúng có gen mã hóa cho T7 RNA polymerase (1 gen T7), gen này được điều khiển bởi promoter lacUV5 [56]. Promoter lacUV5 chính là một dạng cải biến từ promoter lac, promoter này có ưu điểm là mạnh hơn rất nhiều so với promoter kiểu dại. Toàn bộ sự sắp xếp của gen mã hóa T7 RNA polymerase và promoter lacUV5 được nằm trên hệ gen của phage λ, một phiên bản đặc biệt của phage λ mang toàn bộ cấu trúc này được gọi là λDE3. λDE3 được chèn vào nhiễm sắc thể của E. coli BL21 để tạo thành chủng biểu hiện E. coli BL21(DE3). Ngoài ra, trên hệ gen của λDE3 cịn có
các gen marker khác như lacI, ind1, sam7, nin5. Tuy nhiên, các gen marker này sẽ không ảnh hưởng tới sự biểu hiện gen ngoại lai.
E. coli BL21(DE3) là vật chủ có nhiều điểm thuận lợi cho việc biểu hiện gen
của DNA plasmid có mang gen đích được điều khiển bởi promoter T7. Thứ nhất, Trong DNA hệ gen của E. coli BL21(DE3) có mang một bản sao của gen mã hóa
T7 RNA polymerase. T7 RNA polymerase là một enzyme có tính đặc hiệu cao cho promoter T7, các gen được điều khiển bởi promoter T7 sẽ được phiên mã một cách quá mức. Một lý do khác nữa, chủng E. coli BL21(DE3) mang các gen đột biến làm mất khả năng tổng hợp các protease như lon và ompT. Protease lon là một protease nội bào, nó thực hiện hai chức năng chính trong tế bào E. coli. Chức năng thứ nhất, protease lon thủy phân các protein bị sai hỏng về mặt cấu trúc, điều này giúp cho tế bào tránh được sự tích lũy những protein khơng cần thiết, trong chức năng này thì gen lon như là một gen quản gia cho tế bào. Chức năng thứ hai, protease lon cũng
thủy phân các protein nội bào (sulA), các protein sau khi thực hiện chức năng, điều này tránh cho tế bào giữ lại những protein không cần thiết (có thể phân giải protein mà chúng ta mong muốn) và protein được phân giải trước khi tế bào được dung giải. Protease ompT là một protease nằm trên màng ngoài của tế bào, protease này có tác dụng giúp cho E. coli phân giải các protein ngoại bào, nó phân giải các
muốn trong quá trình tách chiết và tinh sạch. Chính nhờ những cải biến này mà
E. coli BL21(DE3) đã trở thành vật chủ hữu hiệu trong việc biểu hiện gen ngoại lai.
Cơ chế cảm ứng promoter T7: Trong tế bào BL21(DE3), chất ức chế lac
ngăn cản sự biểu hiện của gen mã hóa cho enzyme T7 RNA polymerase. Do dó, trong điều kiện bình thường chất ức chế lac sẽ bám vào vùng operator lac nằm giữa promoter lac và gen mã hóa cho enzyme T7 RNA polymerase. Sự liên kết của chất ức chế lac với operator lac sẽ ngăn cản sự phiên mã của gen mã hóa T7 RNA
polymerase. Tuy nhiên, trong tế bào BL21(DE3) ln có một lượng nhỏ T7 RNA polymerase được biểu hiện và có mặt trong tế bào. Cịn trong điều kiện có mặt của chất cảm ứng IPTG, chất cảm ứng này sẽ liên kết với chất ức chế lac và sự liên kết này làm thay đổi cấu trúc của chất ức chế nên khơng có khả năng liên kết với operator. Do đó, tế bào tạo ra nhiều T7 RNA polymerase trong điều kiện có mặt của chất cảm ứng. Enzyme T7 RNA polymerase là enzyme đặc hiệu cho promoter T7, nhờ đó mà protein được mã hóa trên plasmid sẽ được biểu hiện quá mức.
Hình 15. Cơ chế cảm ứng promoter T7 bằng chất cảm ứng IPTG ở tế bào