Như đã nêu trên, các cơng trình nghiên cứu về sản xuất hydro sinh học từ lên men tối của vi sinh vật đã được thực hiện rất nhiều tại các quốc gia trên thế giới và đã được ứng dụng trên quy mơ cơng nghiệp. Nó thu hút sự quan tâm lớn của cả các nhà nghiên cứu và chính phủ các quốc gia. Các quốc gia cơng nghiệp đã tăng đầu tư trong phát triển năng lượng hydro ít nhất 20,5% mỗi năm trong 5 năm qua theo khảo sát của Bộ Năng Lượng Mỹ. Nhật Bản là một trong những nước đầu tiên trên thế giới nghiên cứu về năng lượng hydro. Các nguồn nguyên liệu cho lên men sản xuất hydro bao gồm bã đậu tương từ ngành công nghiệp đậu tương, cám gạo, vỏ táo, vỏ khoai tây, nước thải từ sản xuất dầu cọ và đậu phụ. Tại trung Quốc và Hungarry, cũng đã tiến hành thử nghiệm sản xuất hydro từ nước thải sản xuất rượu gạo và bùn của các sản phẩm thủy phân từ bột giấy [46, 62, 79].
Ở nước ta hiện nay nghiên cứu về sản xuất hydro cịn ít và nhiều hạn chế. Đặc biệt là những nghiên cứu về sản xuất hydro sinh học từ chi Clostridium. Nghiên cứu của Đặng Thị Yến và cộng sự về tuyển chọn và định danh một số chủng có khả năng sinh hydro phân lập từ phân gia súc tại Việt Nam đã phân lập được 3 chủng thuộc chi Clostridium [5]. Đồng thời nhóm nghiên cứu cũng đã thực hiện khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh khí hydro của chủng vi khuẩn
Clostridium sp. Tr2 trong điều kiện lên men vi hiếu khí với nguồn cơ chất rỉ đường
[9]. Để có thể sản xuất hydro sinh học sử dụng như nguồn năng lượng sạch và thân thiện với mơi trường thì việc thực hiện thêm các nghiên cứu ở Việt Nam là hết sức
cần thiết. Bởi vậy đề tài của tôi thực hiện phân lập và tuyển chọn một số chủng
Clostridium sp. kị khí ưa ấm có khả năng sinh hydro từ phân gia súc tại Miền Bắc
Việt Nam. Đồng thời khảo sát các điều kiện tối ưu cho việc sản xuất hydro sinh học từ chủng Clostridium sp. có hiệu suất sinh hydro cao từ các chủng đã phân lập
được. Ngồi ra chúng tơi cũng khảo sát một số nguyên liệu đầu vào giá rẻ cho lên men sinh hydro như bã đậu, bột ngô. Kết quả của đề tài sẽ là nền tảng cho cho sản xuất hydro sinh học trên quy mơ lớn hơn, góp phần giải quyết các vấn đề về thiếu hụt năng lượng và ô nhiễm môi trường.
CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Nguyên liệu và thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
- Các mẫu phân gia súc gồm phân trâu, bò được lấy từ một số tỉnh phía Bắc: Thái Nguyên, Lạng Sơn, Bắc Kạn, Bắc Giang, Hà Nội. Mẫu phân voi lấy tại Công viên Thủ Lệ - Hà Nội.
2.1.2. Thiết bị
- Bể lắc ổn nhiệt (water shaking bath; Model: WSB – 30; Serial no: 0398272117PO10; Hàn Quốc).
- Máy sắc kí khí (Gas Chromatography – GC; 7890A; serial #: us11501033 - USA) để đo lượng khí H2 sinh ra. Máy soi và chụp ảnh gel GelDoc (BioRad, Mỹ).
- Bình khí N2 pure và dây dẫn khí để tạo mơi trường kị khí (Model: Tornado LS/B – He; Vietnam).
- Cân điện tử để xác định trọng lượng các thành phần của môi trường (Model: precisa 310M; Thụy Sỹ).
- Máy ly tâm lạnh (Eppendorf, Đức); máy PCR (Mastercycler, Eppendorf, Đức); hệ thống điện di biến tính DGGE (Bio Rad, Mỹ); hệ thống điện di gel agarose (NixTechnik, Pháp); Kính hiển vi quang học Olimpus (Nhật).
- Box cấy kị khí (Model: Whitley VA 500 worksstation, Anh), tủ ổn nhiệt (Imperial III).
- Máy đo OD để xác định khả năng sinh trưởng của vi sinh vật (Model: Biomate 3; serial no: 2KBK 138001; Mỹ).
2.1.3. Các dụng cụ
- Bình serum 15 ml, 100 ml, nắp cao su và nắp nhôm, kim tiêm để nuôi cấy kị khí. Gas-tight syringe (P/N 008160; 1MR-VLL-GT; C04-A1831 –Australia) để lấy mẫu khí cho GC, dụng cụ kẹp nắp nhôm (Handy crimper for aluminum seal), pipet, đầu côn, đĩa petri, ống eppendorf, ống falcol, bình tam giác, ống đong, ống nghiệm…
2.2. Môi trường
- Danh mục hóa chất, xuất xứ Pepton: Merck Glucose: Merck KH2PO4: Merck NaHCO3: Merck K2HPO4: Merck Reazurin: Sigma Và một số hóa chất thơng dụng khác
Cao nấm men: Merck NaCl: Merck
CaCl2.6H2O: Merck MgSO4: Merck Agar : Merck
2.2.1. Môi trường PY (1000ml): Sử dụng để làm giàu và phân lập vi khuẩn sinh hydro hydro
Trong nghiên cứu này, môi trường nuôi cấy được chuẩn bị cho phương pháp lên men theo mẻ (batch fermentation) dưới điều kiện kị khí [35].
Peptone: 10 g Yeast extract: 10 g Glucose: 10 g Reazurine: 1mg Salt solution: 40 ml H2O 960 ml pH = 5,0 100 ml salt solution gồm: KH2PO4: 0,1 g K2HPO4: 0,1 g NaHCO3: 1 g NaCl: 0,2 g CaCl2: 0,02 g MgSO4: 0,02 g Dung dịch dạ cỏ (trâu): 50 ml pH = 5,5
Sau khi pha môi trường xong, pH môi trường sẽ được điều chỉnh về 7,0 bằng NaOH 1%. Cho mơi trường vào bình serum, khử trùng ở 121°C, 1atm, thời gian 20 phút sử dụng nồi hấp.
2.2.2. Môi trường PYA: Được bổ sung thêm 16g/l agar vào môi trường PY khử trùng ở 121°C, 1atm, thời gian 20 phút sử dụng nồi hấp phục vụ cho phân lập vi trùng ở 121°C, 1atm, thời gian 20 phút sử dụng nồi hấp phục vụ cho phân lập vi khuẩn trên đĩa petri.
2.2.3. Môi trường với nguồn cơ chất là bã đậu
- Nguyên liệu: Trong nghiên cứu này bã đậu được mua tại làng Đa Sĩ – Hà Đông – Hà Nội.
- Phương pháp tiền xử lí bã đậu:
Có nhiều loại acid sử dụng cho quá trình tiền xử lý bao gồm: H2SO4, HCl, H3PO4,HNO3…[73]. Trong nghiên cứu này bã đậu được tiền xử lý bằng phương pháp hóa học sử dụng dung dịch H2SO4 lỗng.
Bã đậu khi mang về sẽ được xử lí nhiệt 90oC trong 15 phút để tiêu diệt các vi khuẩn tiêu thụ hydro
Sau đó bã đậu được pha lỗng với nước cất ở tỉ lệ 1:4 (w/w) Trộn đều bằng máy xay trong khoảng 1 phút
Tiếp tục được xử lí với H2SO4 0,5% (v/v) trong vòng 5 phút để làm tăng hàm lượng carbohydrate hòa tan
Các chỉ tiêu COD, tổng nitơ, tổng photpho được phân tích tại Trung tâm kiểm định môi trường - Cục cảnh sát môi trường Hà Nội
2.2.4. Môi trường với nguồn cơ chất bột ngô
- Nguyên liệu: Trong nghiên cứu này bột ngô được mua tại Đồng Hỷ- Thái Nguyên.
- Phương pháp tiền xử lý bột ngô: bột ngô được tiền xử lý theo phương pháp hóa học sử dụng H2SO4 0,5% [11].
Bột ngô khi mang về sẽ được cân và cho vào bình tam giác, được xử lí nhiệt 90oC trong 15 phút để tiêu diệt các vi khuẩn tiêu thụ hydro.
Sau đó được pha lỗng với nước cất ở tỉ lệ 1:4 (w/w) Trộn đều bằng máy xay trong khoảng 1 phút
Tiếp tục được xử lí với H2SO4 0,5% (v/v) với tỷ lệ nguyên liệu / dung dịch 1/10 (w/v), tiến hành đun nóng hỗn hợp ở 1210 C trong khoảng thời gian 50 phút.
- Đo nồng độ đường khử: Nồng độ đường khử được đo bằng phương pháp Graxianop [38].
Nguyên tắc
Đường khử khi đun nóng với dung dịch kiềm ferixyanua sẽ khử ferixyanua thành feroxyanua và đường trở thành acid đường. Dùng metyl xanh làm chất và sẽ mất màu sau khi phản ứng kết thúc.
Phương trình phản ứng như sau:
2K3Fe(CN)6 + 2KOH + CH2OH(CHOH)4CHO 2K4Fe(CN)6 + 2H2O + HOOC(CHOH)4COOH.
Dụng cụ
Bình tam giác, pipet, bếp điện Hóa chất
- Dụng dịch ferixyanua kali 1%: 11g K3Fe(CN)6 hòa tan trong nước cất và định mức tới 1l.
- Dung dịch KOH 2N: cân 140g KOH hòa tan vào trong 1l nước cất - Dung dịch xanh metylen 0,5%
Tiến hành
Lấy đúng 20ml dung dịch ferixyanua kali cho vào bình tam giác 250ml thêm vào đó 5ml dung dịch KOH 2N, thêm vào đó 3-4 giọt xanh metylen (nếu nồng độ dung dịch thấp hơn 0,25% thì lấy 10ml ferixyanua và 2,5ml dung dịch KOH 2N). Lắc nhẹ và đặt lên bếp điện hay bếp ga đun sôi. Chuẩn độ từ từ bằng mẫu cần xác định nồng độ đường (dịch thủy phân), vừa chuẩn vừa lắc cho đến khi dịch khơng đổi màu thì dừng lại. Xác định số ml mẫu đã dùng để chuẩn độ.
Cách tính lượng đường khử trong mẫu phân tích: Đ ng kh = 0,025 x 1000 x h s pha lỗng
V m u Trong đó:
- 0,025: là hệ số gam K3Fe(CN)6 có trong 20ml dung dịch K3Fe(CN)6 - Vmẫu: là thể tích mẫu dùng để chuẩn độ (ml).
2.2.5. Các môi trường khác
Môi trường Indole cho thử nghiệm Indole
Pepton 1 g/l
pH 7,2-7,6
Môi trường cho thử nghiệm Urease
Pepton 1 g/l NaCl 5 g/l Glucose 1 g/l KH2PO4 2 g/l Dung dịch đỏ phenol 0,2% 2 ml Agar 20 g/l pH 6,8 – 6,9
Môi trường cho thử nghiệm VP
Pepton 7 g/l
NaCl 5 g/l
Glucose 5 g/l
pH 7,5
Môi trường cho thử nghiệm MR
Pepton 5 g/l
NaCl 5 g/l
Glucose 5 g/l
pH 7,0 – 7,2
Môi trường cho thử nghiệm Citrate (Simmons citrate agar)
NaCl 5 g/l MgSO4 0,2 g/l NH4H2PO4 1 g/l K2HPO4 1 g/l Brommthymol blue 0,08 g/l Agar 18 g/l
Môi trường thủy phân gelatimase
Pepton 5 g/l
Gelatin 100 - 150 g/l
pH 7,2 – 7,4
Môi trường cho thử nghiệm catalase
H2O2 1 ml
Môi trường Indole cho thử nghiệm Lipase
Pepton 10 g/l
NaCl 5 g/l
CaCl2.2H2O 0,1 g/l
Agar 9 g/l
pH 7,4
Mơi trường thử hoạt tính Lecithinase
Lịng đỏ trứng 5 ml/L
NaCl (0.9%) 5 ml/L
Pepton 10 g/l
2.3. Phương pháp nghiên c
Sơ đồ nghiên cứu thí nghiệm đ
Hình 2.1: Sơ đồ nghi
2.3.1. Xử lý mẫu và nuôi
- Các mẫu thu thập đ
bỏ các tạp chất. Đem tiền xử lý mẫu bằng máy gia nhiệt ở 100 [22].
- 8ml môi trường sẽ đ cao su và nắp nhôm bên
- Headspace của b trong bình nhằm tạo mơi tr khơng cịn thấy hiện tư sẵn sàng cho việc làm giàu ch
Thu mẫu
Làm giàu và thử sinh hydro
Phân lập và định danh
Tìm kiếm vi sinh vật sinh hydro cao nhất
Tối ưu các điều kiện sinh hydro
Thử nghiệm trên nguồn sản phụ phẩm nông nghiệp: bã
đậu và bột ngô
Nuôi cấy kết hợp các chủng vi sinh phân lập được
2.3. Phương pháp nghiên cứu
ứu thí nghiệm được thể hiện dưới hình 2.1 d
ên cứu phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh hydro
u và ni cấy
ẫu thu thập được pha lỗng trong nước cất, lọc qua giấy lọc để loại ỏ các tạp chất. Đem tiền xử lý mẫu bằng máy gia nhiệt ở 100
ờng sẽ được cho vào bình serum 15ml sau ên ngồi.
ủa bình serum được sục khí N2 tinh khiết để loại bỏ hết O ằm tạo mơi trường kị khí. Khi mơi trường trở lên trong su
ượng chuyển sang màu hồng của thuốc thử àm giàu chủng.
• Thu mẫu phân gia súc từ một số tỉnh miền Bắc • Ni cấy mẫu trong bình serum
hydro sinh ra từ mỗi mẫu, chọn các mẫu cho sản lượng hydro cao (ml/L mơi trường)
hử sinh hydro
• Phân lập các vi sinh vật kị khí mẫu được chọn và định danh loại Bergey kết hợp kĩ thuật sinh đo quang phổ protein
và định danh
• Xác định lại khả năng sinh chủng đã phân lập, định danh, hydro cao nhất
vi sinh vật kị khí cao nhất
• Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng trưởng và sinh hydro đối với được lựa chọn
Tối ưu các điều kiện sinh
• Ni cấy và xác định khả năng sinh khí hydro theo thời gian lựa chọn
Thử nghiệm trên nguồn sản- phụ phẩm nơng nghiệp: bã
đậu và bột ngơ
• Ni cấy trong các bình Clostridium được chọn với vi xem xét khả năng sinh khí
Ni cấy kết hợp các chủng vi sinh phân lập được
ình 2.1 dưới đây:
ển chọn chủng vi khuẩn sinh hydro
ớc cất, lọc qua giấy lọc để loại ỏ các tạp chất. Đem tiền xử lý mẫu bằng máy gia nhiệt ở 1000 C trong 30 phút
ào bình serum 15ml sau đó được đóng nắp
ết để loại bỏ hết O2 ên trong suốt và lắc lên ốc thử thì mơi trường đã u phân gia súc từ một số tỉnh miền Bắc
m, xác định lượng hydro sinh ra từ mỗi mẫu, chọn các mẫu cho sản
(ml/L mơi trường)
khí sinh hydro trong danh bằng khóa định sinh học phân tử và
hydro cao của các danh, chọn ra chủng sinh hưởng tới quá trình sinh với chủng sinh hydro năng sinh trưởng và gian với chủng được bình serum chủng
Hình 2.2: Phương pháp sục khí nitơ
- Cấy giống từ 5-10% (v/v) khi vẫn đang tiến hành sục khí N2.
- Cuối cùng cho bình serum đã cấy vào bể lắc ổn nhiệt và nuôi cấy ở 35oC, 150 rpm.
- Sau 2 ngày nuôi cấy chọn những mẫu có khả năng sinh khí hydro cao cấy chuyển sang bình làm giàu lần thứ hai và thứ ba để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
- Lấy dịch nuôi cấy lần thứ 3 pha loãng, cấy trải trên đĩa thạch môi trường PYA trong tủ ni cấy kị khí.
- Sau 24- 48 giờ, quan sát và lựa chọn những khuẩn lạc to, riêng rẽ nuôi lại kiểm tra khả năng sinh H2.
- Từ các đĩa Petri, chúng tôi chọn được các khuẩn lạc riêng rẽ dựa vào đặc điểm khác nhau về hình dáng, kích thước, màu sắc, bề mặt, mép, độ lồi. Sau đó chúng tơi đã ni thuần chủng tinh khiết và giữ giống phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.3.2. Định danh vi khuẩn dựa vào khóa định loại Bergey
Các chủng thuần khiết phân lập được sẽ được thử nghiệm về hình thái, tính chất sinh lý, sinh hóa. Mặc dù phương pháp này khơng hồn tồn chính xác nhưng đây là bước đầu tiên trong nghiên cứu phân loại vi sinh vật. Các thí nghiệm được thực hiện như sau [2]:
Nhuộm Gram
Nhuộm Gram là phương pháp thực nghiệm hữu hiệu trong bước đầu tiên xác định vi sinh vật, phân biệt các lồi vi khuẩn thành hai nhóm Gram dương và Gram âm dựa trên các đặc tính lý hóa của thành tế bào.
Khả năng sinh bào tử
Xác định khả năng sinh bào tử bằng phương pháp sốc nhiệt. Vi khuẩn có khả năng sinh hydro được nuôi trong mơi trường ni cấy 1- 2 ngày. Sau đó đem dịch ni cấy ủ trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 85oC trong 15 phút. Dịch nuôi cấy sau khi sốc nhiệt được nuôi cấy lại. Nếu thấy vi khuẩn sinh trưởng trở lại và có khả năng tạo khí thì vi khuẩn có khả năng sinh hydro đó có khả năng tạo bào tử.
Thử nghiệm Catalase
Catalase là enzyme có khả năng phân hủy hydrogen peroxide (H2O2) thành nước (H2O) và oxy (O2). Các thử nghiệm catalase nhằm phát hiện ra sự có mặt các enzyme catalase trong vi khuẩn, nó là thử nghiệm cần thiết để phân biệt catalase âm và catalase dương tính.
Thử nghiệm khả năng di động
Để xác định khả năng di động của vi khuẩn, cấy khuẩn lạc đâm sâu vào môi trường thạch mềm (0,5% agar) trong ống nghiệm, khoảng 2/3 độ dài thạch. Ủ ở 37oC từ 18- 24 giờ. Phản ứng dương tính vi khuẩn di động sẽ làm môi trường đục, sinh trưởng lan ra khỏi vết cấy. Phản ứng âm tính vi khuẩn chỉ sinh trưởng quanh đường cấy, môi trường không bị đục.
Thủy phân gelatinese
Xác định khả năng sinh enzyme gelatinese làm tan chảy môi trường gelatin. Để phân giải ngoại bào gelatin, các vi khuẩn này phải có khả năng sinh enzyme ngoại bào gelatinese. Chủng vi khuẩn được cấy riêng rẽ vào ống nghiệm. Ủ vi khuẩn ở 37oC trong điều kiện kỵ khí. Sau 5 - 7 ngày lấy các ống nghiệm đặt vào tủ nhiệt độ 4oC 1- 2 giờ ở nhiệt độ thấp gelatin sẽ đơng lại. Nếu gelatin bị thủy phân thì mơi trường tan chảy, môi trường ở dạng rắn chứng tỏ gelatin không bị thủy phân.
Thử nghiệm Indole
Vi khuẩn có enzyme tryptophanase có khả năng thủy phân axit amin tryptophan sinh indol, axit pyruvic và NH3+. Indol sinh ra sẽ kết hợp với nhóm
(CHO)- của p-dimethylaminobenzaldehyd có trong thuốc thử Kovac hình thành nên phức hợp màu đỏ.
Thử nghiệm hoạt tính Lecithinase
Trộn lịng trắng trứng với cùng trọng lượng nước muối sinh lý tạo thành dịch huyền phù. Lấy 10ml dịch huyền phù trên hòa tan vào môi trường thạch- peptone đã