3.1. Phân lập các chủng vi khuẩn Clostridium sp ưa ấm lên men kị khí có
3.1.3. Định danh lồi bằng phân tích 16S rDNA
Sau khi tách chiết DNA genome và tinh sạch, DNA của các chủng vi khuẩn được dùng làm khuôn để nhân bản đoạn gen mã hóa 16S rRNA nhờ sử dụng cặp mồi đặc hiệu 27F và 1527R [46]. Sau khi kiểm tra kết quả PCR (Hình 3.3), sản
phẩm PCR sau khi tinh sạch sẽ đ ribosome.
Kết quả điện di genome v kĩ thuật PCR, các mẫu kí hiệu v khơng bị nhiễu và khơng có băng ph phù hợp với kích thước của đoạn gen m
Hình 3.3: Kết quả điện
M: Marker (100pb
Kết quả BLAST các chủng đ
phản ánh tính chính xác của việc định danh s Kết quả giải trình t
tương đồng trên Genbank cho th đoạn 16S rDNA của chủng
được định danh là Enterobacter cloacae
đồng 98% so với đoạn 16S r được định danh là Clostridium tương đồng 100% so v
đó chủng này được định danh đồng 100% so với đoạn 1
M (-)
ẩm PCR sau khi tinh sạch sẽ được gửi đi để giải trình t
ết quả điện di genome và sản phẩm nhân bản gen mã hóa 16s rRNA b ĩ thuật PCR, các mẫu kí hiệu và đánh số thứ tự như trong h
ơng có băng phụ, kích thước điện di sản phẩm khoảng 1500bp, ớc của đoạn gen mã hóa 16S rARN của vi khuẩn.
ết quả điện di sản phẩm nhân bản gen 16S rDNA b PCR
(100pb-1kb); (-): Đối chứng âm; (+): Đối chứng d
ết quả BLAST các chủng được hiển thị trong Bảng 3.3. Kết quả n ản ánh tính chính xác của việc định danh sơ bộ theo khóa phân loại Bergey.
ình tự khi so sánh với các trình tự gen 16S rD ên Genbank cho thấy: Chủng CB1 có tỉ lệ tương đ
ủa chủng Enterobacter cloacae MCE64A9 trên ngân hàng gen và
Enterobacter cloacae CB1. Chủng vi khuẩn CB2 có độ t ới đoạn 16S rDNA của chủng Clostridium sp. JC2
Clostridium sp.CB2, chưa đủ cơ sở định danh đến lo
so với đoạn 16S rDNA của chủng Clostridium beijerinckii ợc định danh là Clostridium beijerinckii CB3. Chủng
ới đoạn 16S rDNA của chủng Clostridium bifermentans
) (+) CB1 CB2 CB3 CT4 CT5 ình tự gen mã hóa 16S ã hóa 16s rRNA bằng ư trong hình có băng rõ nét, ản phẩm khoảng 1500bp, ủa vi khuẩn. NA bằng kĩ thuật
ối chứng âm; (+): Đối chứng dương.
ợc hiển thị trong Bảng 3.3. Kết quả này đã ộ theo khóa phân loại Bergey.
ự gen 16S rDNA của các loài ương đồng 99% so với ên ngân hàng gen và ủng vi khuẩn CB2 có độ tương JC272, do đó chủng này ở định danh đến loài. Chủng CB3 Clostridium beijerinckii PS3, do ủng CT4 có hệ tương Clostridium bifermentans DPH – 1 1500bp
và được định danh là Clostridium bifermentans CT4. Chủng CT5 có hệ số tương đồng 99% với đoạn 16S rDNA của chủng Clostridium bifermentans ATCC 638 và được định danh là Clostridium bifermentans CT5.
Bảng 3.3: Kết quả định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử Ký hiệu Ký hiệu
chủng Tên chủng trên ngân hàng Gen
Tỉ lệ tương đồng (%)
CB1 Enterobacter cloacae MCE64A9 99%
CB2 Clostridium sp. JC272 98%
CB3 Clostridium beijerinckii PS3 100%
CT4 Clostridium bifermentans DPH-1 100%
CT5 Clostridium bifermentans ATCC 638 99%
Chủng CB1: kết quả phân tích trình tự 16S rDNA và kết quả thử nghiệm dựa vào khóa phân loại Bergey cho thấy chủng CB1 thuộc loài Enterobacter cloacae.
Đây là chi được biết đến là nhóm trực khuẩn hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện, Gram âm có khả năng sử dụng nguồn glucose lên men sinh hydro [58]. Phản ứng citrate và catalase dương tính, có khả năng di động là điểm tương đồng với Enterobacter cloacae [58]. Chủng vi khuẩn này đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu trước đó
như nghiên cứu của Harun Irrina và cộng sự (2012) [31].
Chủng CB2: dựa theo kết quả phân tích trình tự rDNA 16s và kết quả thử nghiệm dựa vào khóa phân loại Bergey cho thấy chủng CB2 thuộc chi Clostridium. Là vi khuẩn Gram dương, hình que, catalase âm tính, có khả năng hình thành bào tử là những đặc điểm điển hình của chi Clostridium. Chủng này có phản ứng citrate âm tính là đặc điểm của hầu hết các loài thuộc chi này [80]. Chủng khơng có khả năng di động tương đồng với một số loài trong chi. Cùng với kết quả phân tích trình tự rDNA 16s chúng tôi kết luận chủng thuộc chi Clostridium, chưa đủ dữ liệu để định danh đến loài.
Chủng CB3: dựa vào các phương pháp định danh cho thấy chủng CB3 thuộc lồi Clostridium beijerinckii - vi khuẩn Gram dương hình que, có khả năng sinh bào tử, lên men sinh hydro, catalase âm tính [80]. Chủng CB3 có khả năng di động, đây cũng là điểm tương đồng với Clostridium beijerinckii [57]. Chủng này có phản ứng citrate và indole âm tính cũng là điểm trùng khớp với Clostridium beijerinckii.
Ngoài ra chủng CB3 được phân lập từ phân bò, đây cũng là nguồn nguyên liệu giàu
Chủng CT4 và CT5: kết quả phân tích trình tự 16S rDNA và kết quả thử nghiệm dựa vào khóa phân loại Bergey 2 chủng thuộc loài Clostridium bifermentans. Chúng cũng có những đặc điểm đặc trưng của chi Clostridium như đã
trình bày ở trên. Khác với Clostridium beijerinckii, cả hai chủng này đều có phản
ứng indole dương tính. Đây cũng là điểm tương đồng với Clostridium bifermentans [80]. Trong 2 chủng này, chủng CT4 có khả năng di động, trong khi chủng CT5 lại khơng có khả năng này. Điều này cũng tượng tự với nghiên cứu của Katarzyna Leja và cộng sự (2014) [42] khi nghiên cứu các đặc điểm sinh hóa của một số chủng
Clostridium bifermentans, cho thấy trong cùng một lồi thì tính chất sinh hóa cũng
có thể khơng đồng nhất. Trên thế giới Clostridium bifermentans đã được sử dụng để nghiên cứu sinh hydro trong nhiều năm qua [81, 82].
Các kết quả trên chỉ ra tính chính xác và sự trùng khớp giữa định danh bằng kĩ thuật sinh học phân tử phân tích trình tự gen mã hóa 16S rDNA và khóa phân loại Bergey. Kết hợp với các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và sinh học phân tử, từ đó chúng tơi có thể khẳng định rằng những kết quả định danh các chủng vi khuẩn sinh hydro là hồn tồn chính xác.