2. Phương pháp nghiên cứu
2.1. Tách chiết ADN tổng số
Các mẫu của chúng tôi bao gồm các mẫu xương và da khô thu được qua người dân bản địa, do vậy điều kiện bảo quản các mẫu này không tốt, dẫn đến chất lượng ADN tổng số lưu dữ được rất ít, và đứt gãy rất nhiều. Ngồi ra, chúng tơi cũng lấy các mẫu bảo tàng được bảo quản trong điều kiện tốt, nhưng tuổi mẫu đã khá cao, (khoảng xấp xỉ vài chục năm). Do vậy, chúng tôi tách chiết ADN tổng số sử dụng bộ kit Dneasy Blood and tissue, với các quy trình đã mơ tả trong nghiên cứu của Lê Đức Minh và cộng sự năm 2013 [3] . Quy trình này của chúng tơi đã được tối ưu để nhằm phục vụ tách chiết các mẫu có chất lượng ADN thấp.
Đầu tiên, mẫu được tiền xử lý rửa bề mặt bằng phương pháp ngâm trong dung dịch Clorox 10% . Bước này giúp loại bỏ các thành phần bề mặt không cần thiết, các loại nấm mốc, vi sinh vật. Tiếp đó, mẫu đựơc lấy ra, rửa sạch bằng nước cất nhiều lần, cuối cùng để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Cuối cùng, chúng tôi sử dụng bộ kít DNeasy blood and tissues với protocol được chỉnh lý [3] để tách chiết ADN tổng số từ các mẫu xương và da khô đã được làm sạch.
Mẫu đã khô được chuyển vào ống eppendorf 1,5ml đồng thời bổ sung 180µl dung dịch đệm ATL và 20µl proteinase K. Hỗn hợp được ủ ở 60°C trong 72 giờ. Proteinase K được bổ sung tiếp tục sau mỗi 24 tiếp theo (tổng cộng lượng proteinase K sử dụng là 60µl).
Sau 72 giờ, dung dịch và mẫu được lấy ra khỏi bể ổn nhiệt, vortex nhẹ trước khi bổ sung 200µl dung dịch đệm AL. Hỗn hợp mới này lại tiếp tục được ủ ở 70°C trong 7 phút, sau đó đựơc lấy ra bổ sung thêm 200µl dung dịch Ethanol 100. Dung dịch trong hỗn hợp thu được sẽ chuyển qua cột lọc 2ml, ly tâm với tốc độ 6000 rcf trong 1 phút. Cột lọc sau ly tâm được chuyển sang ống 2ml mới. Dung dịch sau ly tâm được loại bỏ.
Bổ sung 500 µl dung dịch đệm AW1 vào cột lọc mới và ly tâm ở 6000 rcf trong 1 phút.
Tương tự bước trên, lần này, cột lọc cũng được chuyển vào ống 2ml mới và loại bỏ dung dịch sau ly tâm. Đồng thời, dung dịch AW2 được bổ sung 500µl vào cột lọc và ly tâm ở 20000 rcf trong 3 phút.
Cuối cùng, cột lọc được chuyển sang ống eppendorf 1,5ml đồng thời bổ sung vào cột lọc 90 µl dung dịch đệm AE, ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Sau đó, ống eppendorf và cột lọc được ly tâm ở 6000 rcf trong 1 phút. Lần này, dung dịch thu được chứa ADN tổng số nên được giữ lại trong ống eppendorf và bảo quản ở âm 4°C.