Nghiên cứu đa dạng di truyền bằng chỉ thị ADN

CHƢƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.3. Nghiên cứu đa dạng di truyền bằng chỉ thị ADN

2.2.3.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số

ADN lúa được tách chiết và tinh sạch theo phương pháp CTAB cải tiến. Phương pháp CTAB cải tiến trên cơ sở phương pháp của Shagai – Maroof (1984) [63]. Quy trình thực hiện gồm các bước:

• Lấy khoảng 1-2g lá mạ (2 tuần tuổi) nghiền với nitơ lỏng trong ống eppendorf thành dạng bột mịn.

• Thêm 1 ml dịch chiết (0,1M Tris-Cl, pH8; 0,05M EDTA; 0,5M NaCl; 0,07% β-mercaptoethanol) và 50µl 10% SDS trộn đều.

• Ủ 30 phút ở 650C, lắc nhẹ. Ly tâm với tốc độ 13000vòng/phút trong 20 phút. • Thu lấy dung dịch nổi ở bên trên cho vào ống eppendorf mới và thêm vào đó một thể tích tương ứng isopropanol, lắc nhẹ.

• Ủ trong đá 10-30 phút.

• Ly tâm với tốc độ 13000vịng/phút trong 10 phút.

• Bỏ pha dịch. Làm khơ kết tủa. Thêm vào 400 µl TE để hồ tan . ã Thờm 1àl RNase (10mg/ml).

• Ủ mẫu ở 370C trong 2h.

ã Thờm 400àl m CTAB (0,2M Tris-Cl, pH7,5; 0,05M EDTA; 2M NaCl; 2% (w/v) CTAB).

• Ủ ở 650C trong 15 phút. Trong khi ủ thỉnh thoảng lắc nh.

ã Thờm 800àl Chloroform/isoamyl alcohol tỷ lệ 24/1 và lắc đều thành dạng sữa.

• Tiếp tục ly tâm với tốc độ 13000vịng/phút trong 15 phút.

• Chuyển phần dịch trong phía trên sang ống eppendorf mới, thêm 1,4ml ethanol 96% và ủ ở nhiệt độ phịng trong 1h.

• Ly tâm với tốc độ 13000vòng/phút trong 10 phút, loại phần dịch và thêm vào 400àl ethanol 70%.

ã Ly tõm vi tốc độ 13000vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ ethanol, cho vào máy quay khơ.

• Hồ tan ADN trong 200àl H2O (hoc TE). ã Bo qun nhit -200C để dùng dần.

Kiểm tra ADN tổng số: Chất lượng và nồng độ ADN tổng số được kiểm tra trên gel agarose 0,8%.

2.2.3.2. Phương pháp PCR với mồi SSR

Các thành phần tham gia vào phản ứng PCR được chuẩn bị trong tấm PCR plate 96 giếng. Thành phần, hàm lượng của các chất trong mỗi phản ứng như trong bảng 2.3.

Bảng 2.3. Thành phần các chất dùng cho mỗi phản ứng PCR với mồi SSR

Stt Thành phần Thể tích (l)

1 H2O cất khử trùng 8.95

2 Buffer 10X 1,5

3 MgCl2 (50mM) 0,45

4 dNTP (1mM) 1,0

5 Taq DNA polymeraza (5U) 0,1

6 Primer forward 5M 0,5

7 Primer Revert 5M 0,5

8 ADN (35ng/ l) 2,0

Tổng thể tích: 15

Sau khi đã có đủ thành phần, hàm lượng các chất cần thiết, tiến hành đặt chương trình chạy cho máy. Chu trình nhiệt trong máy PCR như sau:

Bảng 2.4. Chƣơng trình chạy của phản ứng PCR Bƣớc Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ

1 94 5 phút 1

55* 30 giây 72 45 giây

3 72 5 phút 1

4 10 ∞ 1

(*): Nhiệt độ gắn mồi - có thể thay đổi tùy theo từng cặp mồi SSR cụ thể

2.2.3.3. Phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%

 Các bước tiến hành

- Cân 0.8g agarose, đong 100ml TBE 0,5X (5,4g Tris base; 2,76g axít boric; 2ml 0,5M EDTA, pH = 8,0) cho vào bình tam giác.

- Đun trong lị vi sóng cho đến khi tạo thành một dung dịch đồng nhất.

- Để nguội đến khoảng 50 - 600C, thêm 5l ethidium bromide (10 mg/ml) và lắc đều.

- Chuẩn bị khay và lược. Đổ dung dịch agarose vào khay sao cho khơng có bọt khí. Chờ khoảng 45 - 60 phút gel đông.

- Rút lược, đặt gel vào bể điện di. Đổ 0,5X TBE ngập mặt gel khoảng 2mm. - Tra sản phẩm PCR đã được trộn với Xylen cyanol vào giếng. tỷ lệ 5l Xylen cyanol /15l mẫu. Thời gian và điện thế sử dụng để điện di dài hay ngắn phụ thuộc vào kích thước của cặp mồi SSR cần kiểm tra. Các mẫu chạy với ladder 25 bp.

- Soi gel trên máy soi cực tím.

2.2.3.4. Phương pháp phân tích kết quả trên gel polyacrylamide

- Lau kỹ bề mặt hai tấm kính 3 lần bằng nước cất, sau đó lau lại 3 lần bằng ethanol 95%, để khô sau mỗi lần lau.

- Lau tấm kính dài với giấy lụa tẩm Rain-X . Để 5 phút cho khô dung dịch.

Chú ý. Tránh làm dính dung dịch này lên tấm kính ngắn.

- Lau tấm kính ngắn với dung dịch dính (Binding solution) được tạo thành bằng cách thêm 2l Bind Silane vào 1ml chứa 95% ethanol và 5% glacial acetic acid.

- Để cho tấm kính khơ, lau tiếp bằng ethanol 95% 1 lần.

- Lắp ghép 2 tấm kính lại với nhau, sử dụng nẹp Sigma 0,4mm.  Chuẩn bị gel polyacrylamide

Chuẩn bị dung dịch 4,5% acrylamide từ dung dịch gốc 40% acrylamide (19:1 = acrylamide 380g; bisacrylamide 20g pha trong 1 lít nước)

- Đổ 60ml dung dịch 4,5% acrylamide (25,2g Urea: 6ml TBE 10X: 6,75ml acrylamide/bis-acrylamide 40% (19:1) vào 1 cốc đong 100ml. Thêm 300l 10% APS (ammonium persulfate) và 60l TEMED (N,N,N’,N’-Tetraethyl - ethylendiamine), trộn đều.

- Bơm dung dịch gel vào giữa hai tấm kính sao cho khơng có bọt khí.

- Cài lược vào giữa hai tấm kính (răng lược hướng ra phía ngồi). Dùng kẹp cố định lược.

- Để gel polyme hóa trong 1 - 2 giờ.  Điện di

- Tháo lược và loại bỏ hết các mảnh gel thừa bám trên mặt tấm kính. - Lắp ráp bộ điện di. Cho 1 lít đệm TBE 1X vào buồng đệm trên và dưới.

- Dùng xylanh đuổi hết bọt khí ở bề mặt phía trên của khn gel.

- Chạy tiền điện di (prerun) với cường độ dịng điện là 50 - 60A, cơng suất 92 - 100W.

- Biến tính các sản phẩm PCR ở 950C trong 5 phút, rồi ngay lập tức đặt vào trong đá và phủ đá lên trên ít nhất 5 phút.

Sản phẩm PCR lúc này đã được trộn với 4l Sequencing Stop solution (10mM NaOH: 95% formamid: 0,05% bromphenol; 0,05% xylene cyanol).

- Tra vào mỗi giếng 5l sản phẩm PCR đã được làm biến tính, các mẫu chạy với ladder 1kb.

Thời gian tra mẫu không kéo dài quá dài để gel không bị nguội đi nhiều. - Tiến hành điện di với công suất 60W và ở 500C, thời gian chạy ngắn hay dài tùy kích thước từng mồi sử dụng.

 Phương pháp nhuộm bạc

+ Chuẩn bị các dung dịch

- Dung dịch cố định/dừng phản ứng (Fix/Stop solution): gồm có 100ml glacial acetic acid và 900ml nước cất.

- Dung dịch nhuộm (Staining solution) được tạo thành bằng cách hòa tan 1g bạc nitrat (AgNO3) vào 1 lít nước cất, sau đó bổ sung thêm 1,5ml formaldehyd

(H2CO) 37%.

- Dung dịch hiện (Developing solution): Hòa tan 30g natri cacbonat (Na2CO3) trong 1 lít nước cất và làm lạnh ở -200C.

Chú ý. (Trước khi sử dụng thêm 1,5ml formaldehyd (H2CO) 37% và 200l natri thiosulfat 10% (Na2S2O.5H2O).

Sau khi chạy điện đi, tháo gỡ tấm kính bám gel và tiến hành các bước sau:

- Cố định gel: Đặt tấm kính vào khay sao cho mặt bám gel hướng lên trên, đổ dung dịch cố định/dừng phản ứng và để trong khoảng 30 phút. Sau đó lấy gel ra khỏi dung dịch. Chú ý. Giữ lại dung dịch này để dùng cho bước sau.

- Rửa gel bằng nước cất 2 lần mỗi lần 5 phút. Cho gel vào dung dịch nhuộm, lắc nhẹ trong 30 phút. Thêm formaldehyd và sodium thiolsufat vào dung dịch hiện. Lấy gel ra khỏi dung dịch nhuộm, rửa lại bằng nước cất trong 5 - 10 giây.

- Đưa gel vào dung dịch hiện và lắc nhẹ đến khi các băng xuất hiện. Cho gel vào dung dịch cố định/dừng phản ứng ở trên trong 3 - 6 phút. Rửa lại gel bằng nước cất. Để gel khơ tự nhiên sau đó ghi nhận kết quả.