Danh sách các mẫu giống lúa Lào dùng trong nghiên cứu

TT Nguồn gen

lúa

Nơi thu thập TT Nguồn gen lúa

Nơi thu thập

2 VL22 Louangphrabang 19 LP29 Khammouan 3 HVL14 Louangphrabang 20 LP04 Vientiane

4 VL47 Vientiane 21 VL67 Louangphrabang 5 LP36 Thakhek 22 LP15 Vientiane

6 LP13 Ban Na Phan 23 VL74 Vientiane 7 VL62 Khammouan 24 LP26 Ban Na Phan 8 XK10 Louangphrabang 25 VL55 Vientiane 9 LP37 Bolikamxay 26 VLCP Nam Ngum 10 VL-NT Ban Na Phan 27 VL50 Vientiane 11 OX01B Nam Ngum 28 VL36 Bolikamxay 12 LP10 Nam Ngum 29 VL72 Vientiane 13 LP21 Vientiane 30 LP01 Thakhek 14 XK08 Louangphrabang 31 HVL22 Vientiane 15 LP03 Vientiane 32 VLKT Vientiane 16 VL26 Vientiane 33 VL61 Thakhek 17 LP30 Thakhek

- Các giống lúa đối chứng: Bắc Thơm 7 được trồng phổ biến ở đồng bằng Bắc Bộ thuộc phân loài phụ Indica,giống ĐS1 thuộc phân loài phụ Japonica.

- Dụng cụ, máy móc, hóa chất và thiết bị thí nghiệm.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Bố trí thí nghiệm

- Bố trí thí nghiệm đánh giá tập đồn theo phương pháp tuần tự không nhắc lại, mỗi giống 2,5m2 (1 x 2,5 m).

- Mật độ: 45 khóm/m2.

- Các khâu kỹ thuật trồng và chăm sóc theo đại trà sản xuất.

2.2.2. Các tính trạng theo dõi và đánh giá

Các tính trạng theo dõi và đánh giá được thực hiện theo Hệ thống đánh giá tiêu chuẩn cây Lúa của IRRI, 1996 [38].

Các giai đoạn sinh trưởng của cây lúa được chia thành 9 giai đoạn như sau: Giai đoạn 1: Nảy mầm Giai đoạn 2: Mạ Giai đoạn 3: Đẻ nhánh Giai đoạn 4: Vươn lóng Giai đoạn 5: Làm đòng Giai đoạn 6: Trỗ bông Giai đoạn 7: Chín sữa Giai đoạn 8: Vào chắc Giai đoạn 9: Chín Các tính trạng theo dõi và đánh giá gồm:

Bảng 2.2: Các tính trạng hình thái nơng học và thang điểm theo IRRI, 1996

TT Tính trạng

1 Dài lá (cm): Đo thực tế lá thứ hai (lá ngay dưới lá đòng). Giai đoạn sinh trưởng 6.

2 Rộng lá (cm): Đo chỗ rộng nhất của lá ngay dưới lá đòng. Giai đoạn sinh trưởng 6.

3 Độ phủ lông của lá (giai đoạn sinh trưởng 5-6): 1- Trơn, 2 - Trung bình, 3 - Phủ lơng dày.

4 Màu phiến lá (giai đoạn sinh trưởng 4-6): 1 - Xanh nhạt, 2 - Xanh, 3 - Xanh đậm, 4 - Tím đỉnh lá, 5 - Tím mép lá, 6 - Có đốm tím, 7 - Tím.

Bảng 2.2: Các tính trạng hình thái nơng học và thang điểm theo IRRI, 1996

TT Tính trạng

5 Màu gốc bẹ lá (giai đoạn sinh trưởng 4-6): 1 - Xanh, 2 - Có sọc tím, 3 - Tím nhạt, 4 - Tím.

6 Góc lá ngay dưới lá địng (giai đoạn sinh trưởng 4-5): 1 - Đứng, 5 - Ngang, 9 - Rũ xuống.

7 Góc lá địng (giai đoạn sinh trưởng 4-5): 1 - Đứng, 3 - Trung bình, 5 - Ngang, 7 - Gập xuống.

8 Dài thìa lìa (mm): Đo từ cổ đến đỉnh lá. Giai đoạn sinh trưởng 4-5. 9 Màu thìa lìa (giai đoạn sinh trưởng 4-5): 1 - Trắng, 2 - Sọc tím, 3 - Tím. 10 Dạng thìa lìa (giai đoạn sinh trưởng 4-5): 1 - Nhọn đến hơi nhọn, 2 - Hai

lưỡi kìm, 3 - Chóp cụt.

11 Màu cổ lá (giai đoạn sinh trưởng 4-5): 1 - Xanh nhạt, 2 - Xanh, 3 - Tím. 12 Màu tai lá (giai đoạn sinh trưởng 4-5): 1 - Xanh nhạt, 2 - Tím.

13 Thời gian sinh trưởng (ngày) tính từ khi gieo đến khi có 85% số hạt chín trên các khóm.

Thời gian sinh trưởng (ngày) tính từ khi gieo đến khi có 50% số bơng lúa trỗ cộng với thời gian từ khi 50% số bơng lúa trỗ đến khi lúa có 80% số hạt chín.

14 Chiều cao cây (cm). Đo từ mặt đất đến đến đỉnh bông dài nhất. Giai đoạn sinh trưởng 8.

15 Số bơng/khóm: Đếm tất cả các bơng trong 1 khóm. Giai đoạn sinh trưởng 8.

16 Góc thân: 1 - Đứng ( 30o), 3 - Trung gian (= 45 o), 5 - Mở (= 60 o), 7 - Tòe ( 60 o), 9 - Bị lan.

Bảng 2.2: Các tính trạng hình thái nông học và thang điểm theo IRRI, 1996

TT Tính trạng

17 Màu sắc ống rạ (giai đoạn sinh trưởng 7 - 9): 1 - Xanh, 2 - Vàng nhạt, 3 - Sọc tím, 4 - Tím.

18 Độ cứng cây (giai đoạn sinh trưởng 8-9): 1 - Cứng, 3 - Cứng trung bình, 5 - Trung bình, 7 - Yếu, 9 - Rất yếu.

19 Dạng bơng phân loại theo cách phân nhánh, góc nhánh sơ cấp và độ đóng hạt (giai đoạn sinh trưởng 8): 1 - Chụm, 5 - Trung gian, 9 - Mở.

20 Độ thốt cổ bơng (giai đoạn sinh trưởng 7-9): 1 - Thoát tốt, 3 - Thoát trung bình, 5 - Vừa đúng cổ bơng, 7 - Thốt một phần, 9 - Khơng thoát được. 21 Trục bông (giai đoạn sinh trưởng 8): 1 - Thẳng đứng, 2 - Uốn xuống.

22 Độ rụng hạt, giữ chặt và vuốt tay dọc bơng và ước tính số % hạt rụng (giai đoạn sinh trưởng 9): 1 - Rất thấp (1%), 3 - Thấp (1-5%), 5 - Trung bình (6-25%), 7 - Dễ rụng (26-50%), 9 - Rất dễ rụng (51-100%).

23 Độ rụng hạt (giai đoạn sinh trưởng 9): 1 - Khó rụng, 5 - Trung bình, 9 - Dễ rụng.

24 Râu đầu hạt (giai đoạn sinh trưởng 7 - 9): 0 - Không râu, 1 - Râu ngắn từng phần, 5 - Râu ngắn toàn phần, 7 - Râu dài từng phần, 9 - Râu dài toàn phần.

25 Màu mỏ hạt (giai đoạn sinh trưởng 7 - 9): 1 - Trắng, 2 - Vàng rơm, 3 - Nâu, 4 - Đỏ, 5 - Đỉnh đỏ, 6-Tím.

26 Màu nhuỵ cái được xác định lúa hoa nở (từ 9 giờ sáng đến 2 giờ chiều, giai đoạn sinh trưởng 6): 1 - Trắng, 2 - Xanh nhạt, 3 - Vàng, 4 - Tím nhạt, 5 - Tím.

27 Màu vỏ trấu (giai đoạn sinh trưởng 9): 0 - Vàng rơm, 1 - Vàng hoặc khía vàng, 2 - Đốm nâu, 3 - Khía nâu, 4 - Nâu, 5 - Hơi đỏ đến tím nhạt, 6 - Đốm

Bảng 2.2: Các tính trạng hình thái nơng học và thang điểm theo IRRI, 1996

TT Tính trạng

tím, 7 - Khía tím, 8 - Tím, 9 - Đen, 10 - Trắng.

28 Độ phủ lông vỏ trấu (giai đoạn sinh trưởng 7-9): 1 - Nhẵn, 2 - Có lơng trên sống vỏ trấu, 3 - Có lơng phần trên, 4 - Lơng ngắn, 5 - Lông dài.

29 Màu mày hạt (giai đoạn sinh trưởng 9): 1 - Vàng rơm, 2 - Vàng, 3 - Đỏ, 4 - Tím.

30 Số hạt/bông. 31 Số hạt chắc/bông.

32 Trọng lượng 1000 hạt: Cân 1000 hạt 13% độ ẩm. 33 Chiều dài hạt (mm): Đo từ gốc vỏ mày lên tới mỏ hạt. 34 Chiều rộng hạt (mm): Đo ngang chỗ rộng nhất giữa hai nửa

vỏ trấu.

35 Tỷ lệ dài/rộng hạt.

36 Màu vỏ gạo: 1 - Trắng, 2 - Nâu nhạt, 3 - ánh nâu, 4 - Nâu, 5 - Đỏ, 6 - Tím một phần, 7 - Tím.

37 Năng suất lý thuyết (tạ/ha) = Mật độ x Số bơng hữu hiệu/khóm x số hạt chắc/bông x khối lượng 1000 hạt (g) x 1/10000.

2.2.3. Nghiên cứu đa dạng di truyền bằng chỉ thị ADN

2.2.3.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số

ADN lúa được tách chiết và tinh sạch theo phương pháp CTAB cải tiến. Phương pháp CTAB cải tiến trên cơ sở phương pháp của Shagai – Maroof (1984) [63]. Quy trình thực hiện gồm các bước:

• Lấy khoảng 1-2g lá mạ (2 tuần tuổi) nghiền với nitơ lỏng trong ống eppendorf thành dạng bột mịn.

• Thêm 1 ml dịch chiết (0,1M Tris-Cl, pH8; 0,05M EDTA; 0,5M NaCl; 0,07% β-mercaptoethanol) v 50àl 10% SDS trn u.

ã 30 phỳt ở 650C, lắc nhẹ. Ly tâm với tốc độ 13000vòng/phút trong 20 phút. • Thu lấy dung dịch nổi ở bên trên cho vào ống eppendorf mới và thêm vào đó một thể tích tương ứng isopropanol, lắc nhẹ.

• Ủ trong đá 10-30 phút.

• Ly tâm với tốc độ 13000vịng/phút trong 10 phút.

• Bỏ pha dịch. Làm khơ kết tủa. Thêm vào 400 µl TE để hồ tan . ã Thờm 1àl RNase (10mg/ml).

• Ủ mẫu ở 370C trong 2h.

ã Thờm 400àl m CTAB (0,2M Tris-Cl, pH7,5; 0,05M EDTA; 2M NaCl; 2% (w/v) CTAB).

• Ủ ở 650C trong 15 phút. Trong khi ủ thỉnh thong lc nh.

ã Thờm 800àl Chloroform/isoamyl alcohol tỷ lệ 24/1 và lắc đều thành dạng sữa.

• Tiếp tục ly tâm với tốc độ 13000vòng/phút trong 15 phút.

• Chuyển phần dịch trong phía trên sang ống eppendorf mới, thêm 1,4ml ethanol 96% và ủ ở nhiệt độ phịng trong 1h.

• Ly tâm với tốc độ 13000vòng/phút trong 10 phút, loại phần dịch và thờm vo 400àl ethanol 70%.

ã Ly tõm với tốc độ 13000vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ ethanol, cho vào máy quay khơ.

• Hồ tan ADN trong 200àl H2O (hoc TE). ã Bo qun nhiệt độ -200C để dùng dần.

Kiểm tra ADN tổng số: Chất lượng và nồng độ ADN tổng số được kiểm tra trên gel agarose 0,8%.

2.2.3.2. Phương pháp PCR với mồi SSR

Các thành phần tham gia vào phản ứng PCR được chuẩn bị trong tấm PCR plate 96 giếng. Thành phần, hàm lượng của các chất trong mỗi phản ứng như trong bảng 2.3.

Bảng 2.3. Thành phần các chất dùng cho mỗi phản ứng PCR với mồi SSR

Stt Thành phần Thể tích (l)

1 H2O cất khử trùng 8.95

2 Buffer 10X 1,5

3 MgCl2 (50mM) 0,45

4 dNTP (1mM) 1,0

5 Taq DNA polymeraza (5U) 0,1

6 Primer forward 5M 0,5

7 Primer Revert 5M 0,5

8 ADN (35ng/ l) 2,0

Tổng thể tích: 15

Sau khi đã có đủ thành phần, hàm lượng các chất cần thiết, tiến hành đặt chương trình chạy cho máy. Chu trình nhiệt trong máy PCR như sau:

Bảng 2.4. Chƣơng trình chạy của phản ứng PCR Bƣớc Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ

1 94 5 phút 1

55* 30 giây 72 45 giây

3 72 5 phút 1

4 10 ∞ 1

(*): Nhiệt độ gắn mồi - có thể thay đổi tùy theo từng cặp mồi SSR cụ thể

2.2.3.3. Phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%

 Các bước tiến hành

- Cân 0.8g agarose, đong 100ml TBE 0,5X (5,4g Tris base; 2,76g axít boric; 2ml 0,5M EDTA, pH = 8,0) cho vào bình tam giác.

- Đun trong lị vi sóng cho đến khi tạo thành một dung dịch đồng nhất.

- Để nguội đến khoảng 50 - 600C, thêm 5l ethidium bromide (10 mg/ml) và lắc đều.

- Chuẩn bị khay và lược. Đổ dung dịch agarose vào khay sao cho khơng có bọt khí. Chờ khoảng 45 - 60 phút gel đông.

- Rút lược, đặt gel vào bể điện di. Đổ 0,5X TBE ngập mặt gel khoảng 2mm. - Tra sản phẩm PCR đã được trộn với Xylen cyanol vào giếng. tỷ lệ 5l Xylen cyanol /15l mẫu. Thời gian và điện thế sử dụng để điện di dài hay ngắn phụ thuộc vào kích thước của cặp mồi SSR cần kiểm tra. Các mẫu chạy với ladder 25 bp.

- Soi gel trên máy soi cực tím.

2.2.3.4. Phương pháp phân tích kết quả trên gel polyacrylamide

- Lau kỹ bề mặt hai tấm kính 3 lần bằng nước cất, sau đó lau lại 3 lần bằng ethanol 95%, để khô sau mỗi lần lau.

- Lau tấm kính dài với giấy lụa tẩm Rain-X . Để 5 phút cho khô dung dịch.

Chú ý. Tránh làm dính dung dịch này lên tấm kính ngắn.

- Lau tấm kính ngắn với dung dịch dính (Binding solution) được tạo thành bằng cách thêm 2l Bind Silane vào 1ml chứa 95% ethanol và 5% glacial acetic acid.

- Để cho tấm kính khơ, lau tiếp bằng ethanol 95% 1 lần.

- Lắp ghép 2 tấm kính lại với nhau, sử dụng nẹp Sigma 0,4mm.  Chuẩn bị gel polyacrylamide

Chuẩn bị dung dịch 4,5% acrylamide từ dung dịch gốc 40% acrylamide (19:1 = acrylamide 380g; bisacrylamide 20g pha trong 1 lít nước)

- Đổ 60ml dung dịch 4,5% acrylamide (25,2g Urea: 6ml TBE 10X: 6,75ml acrylamide/bis-acrylamide 40% (19:1) vào 1 cốc đong 100ml. Thêm 300l 10% APS (ammonium persulfate) và 60l TEMED (N,N,N’,N’-Tetraethyl - ethylendiamine), trộn đều.

- Bơm dung dịch gel vào giữa hai tấm kính sao cho khơng có bọt khí.

- Cài lược vào giữa hai tấm kính (răng lược hướng ra phía ngồi). Dùng kẹp cố định lược.

- Để gel polyme hóa trong 1 - 2 giờ.  Điện di

- Tháo lược và loại bỏ hết các mảnh gel thừa bám trên mặt tấm kính. - Lắp ráp bộ điện di. Cho 1 lít đệm TBE 1X vào buồng đệm trên và dưới.

- Dùng xylanh đuổi hết bọt khí ở bề mặt phía trên của khn gel.

- Chạy tiền điện di (prerun) với cường độ dịng điện là 50 - 60A, cơng suất 92 - 100W.

- Biến tính các sản phẩm PCR ở 950C trong 5 phút, rồi ngay lập tức đặt vào trong đá và phủ đá lên trên ít nhất 5 phút.

Sản phẩm PCR lúc này đã được trộn với 4l Sequencing Stop solution (10mM NaOH: 95% formamid: 0,05% bromphenol; 0,05% xylene cyanol).

- Tra vào mỗi giếng 5l sản phẩm PCR đã được làm biến tính, các mẫu chạy với ladder 1kb.

Thời gian tra mẫu không kéo dài quá dài để gel không bị nguội đi nhiều. - Tiến hành điện di với công suất 60W và ở 500C, thời gian chạy ngắn hay dài tùy kích thước từng mồi sử dụng.

 Phương pháp nhuộm bạc

+ Chuẩn bị các dung dịch

- Dung dịch cố định/dừng phản ứng (Fix/Stop solution): gồm có 100ml glacial acetic acid và 900ml nước cất.

- Dung dịch nhuộm (Staining solution) được tạo thành bằng cách hòa tan 1g bạc nitrat (AgNO3) vào 1 lít nước cất, sau đó bổ sung thêm 1,5ml formaldehyd

(H2CO) 37%.

- Dung dịch hiện (Developing solution): Hòa tan 30g natri cacbonat (Na2CO3) trong 1 lít nước cất và làm lạnh ở -200C.

Chú ý. (Trước khi sử dụng thêm 1,5ml formaldehyd (H2CO) 37% và 200l natri thiosulfat 10% (Na2S2O.5H2O).

Sau khi chạy điện đi, tháo gỡ tấm kính bám gel và tiến hành các bước sau:

- Cố định gel: Đặt tấm kính vào khay sao cho mặt bám gel hướng lên trên, đổ dung dịch cố định/dừng phản ứng và để trong khoảng 30 phút. Sau đó lấy gel ra khỏi dung dịch. Chú ý. Giữ lại dung dịch này để dùng cho bước sau.

- Rửa gel bằng nước cất 2 lần mỗi lần 5 phút. Cho gel vào dung dịch nhuộm, lắc nhẹ trong 30 phút. Thêm formaldehyd và sodium thiolsufat vào dung dịch hiện. Lấy gel ra khỏi dung dịch nhuộm, rửa lại bằng nước cất trong 5 - 10 giây.

- Đưa gel vào dung dịch hiện và lắc nhẹ đến khi các băng xuất hiện. Cho gel vào dung dịch cố định/dừng phản ứng ở trên trong 3 - 6 phút. Rửa lại gel bằng nước cất. Để gel khơ tự nhiên sau đó ghi nhận kết quả.

2.2.4. Phương pháp phân loại dưới loài

Phân loài phụ Indica, Japonica theo phương pháp phân loại nhanh của Oka,

(1958)[57]: Mỗi giống lúa sử dụng 10 hạt thóc, ngâm trong dung dịch 1,5% phenol (C6H6OH) trong 6 giờ. Sau đó hong khơ ở nhiệt độ 30oC trong hai ngày (48 giờ) để xác định sự bắt màu của hạt thóc. Những giống có hạt thóc chuyển sang màu nâu đỏ là lúa Indica, không chuyển màu là lúa Japonica.

2.2.5. Phân tích và xử lý số liệu

2.2.5.1. Phân tích số liệu kiểu hình

Số liệu đánh giá các tính trạng hình thái nơng học được phân tích, xử lý trên phần mềm Excel.

2.2.5.2. Phân tích số liệu kiểu gen

Hệ số tương đồng di truyền và khoảng cách di truyền theo công thức của Nei (1972)[54]: I = 2 1 12 Q Q q và D = - ln (I) Trong đó: I: Hệ số tương đồng di truyền,

D: Khoảng cách di truyền,

q12: Số các alen đồng nhất ở cả 2 mẫu, Q1 và Q2: Tổng số các alen của giống 1 và 2.

- Đa da ̣ng di truyền alen của các chỉ thi ̣ SSR được đá nh giá thông qua hê ̣ s ố PIC [25] và được tính theo phương trình:

Trong đó: Pij : là tần số xuất hiện của alen thứ j tương ứng với mồi i.

Giá trị PIC càng lớn tức là mức độ đa hình của locus do mồi i khuếch đại càng lớn, tức là càng nhiều alen được sinh ra.

Sự có mă ̣t hay vắng mă ̣t của các alen của từng chỉ thi ̣ SSR được ghi nhâ ̣n cho tất cả các giống lúa nghiên cứu , trong đó 0 là khơng có băng ADN và 1 là có băng ADN ở cùng một vị trí alen . Sớ liê ̣u được nhập vào Excel và xử lý bằng chương trình NTSYS-pc v. 2.1 [60] để xây dựng ma trâ ̣n tương đồng di truyền . Tiếp theo, sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hê ̣ di truyền giữa các giống lúa nghiên cứu được xây dựng bằng phương pháp phân nhóm UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical averages).

CHƢƠNG 3

KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả đánh giá một số đặc tính nơng sinh học của các mẫu giống lúa Lào.