Chƣơng 2 : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.3. Phƣơng pháp, kỹ thuật sử dụng trong nghiêncứu
2.2.3.1. Lấy mẫu van tim
- 45 lá van đƣợc lấy từ van động mạch chủ lợn khỏe mạnh, có đăng ký trƣớc với chủ lò mổ để đảm bảo vệ sinh, không cho ăn một ngày trƣớc khi giết mổ. Qui trình lấy van tim đƣợc tiến hành nhƣ sau: Lợn đƣợc làm sạch vùng ngực, sát trùng, mở thông vùng ngực, dùng dao giết lợn thông thƣờng lấy toàn bộ quả tim và các cuống mạch lớn. Chú ý thao tác nhanh để đảm bảo tim lấy ra cịn nóng. Ngâm ngay vào dung dịch sinh lý có pha kháng sinh, chuyển nhanh về lab. Bảo quản mơ để phẫu tích lấy van động mạch chủ.
45 lá van động mạch chủ lợn
Nhóm chứng khơng bảo quản
(5 lá van) ( Bảo quản 3 tháng (20 lá van) Bảo quản 6 tháng (20 lá van)
So sánh hình thái đại thể, vi thể, siêu vi thể, khả năng sống của tế bào mô van tim trƣớc và sau bảo quản
Hình 2.2. Lấy một trong ba lá van làm mẫu nghiên cứu
Chỉ tiêu: van lấy trong 10 phút đầu sau khi giết lợn (giai đoạn thiếu máu nóng), trong điều kiện vơ trùng, cịn nóng, cấy kiểm tra vi khuẩn, nấm.
A: Chứng B: Bảo quản 3 tháng C: Bảo quản 6 tháng
Hình 2.3. Sơ đồ lấy mẫu lá van tim nghiên cứu
Sau đó tại mỗi lá van lấy:
- 1 mẫu để làm tiêu bản nhuộm H.E và Masson đánh giá cấu trúc vi thể chung của mô (tế bào, sợi)
- 1 mẫu làm tiêu bản hiển vi điện tử xuyên (TEM) đánh giá siêu cấu trúc - 1 mẫu nhuộm Trypan Blue để đánh giá chất lƣợng sống của tế bào mô van tim.
2.2.3.2. Xử lý và bảo quản lạnh sâu van tim a. Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất mơi trường
- Bộ dụng cụ: kéo cong, kéo thẳng, nỉa cong không mấu, nỉa thẳng khơng mấu - Bát to (dung tích trên 3000ml)
- Hộp chuyên dụng để giữ, bảo quản và vận chuyển van tim - Săng, quần áo mổ vô trùng, găng, gạc vơ trùng
- Hóa chất xử lý van tim: nƣớc muối sinh lý, RPMI 1640, kháng sinh vancomycin, amikacin, amphotericin B
- Hóa chất bảo quản lạnh sâu van tim: RPMI 1640, DMSO, FBS, penicillin, streptomycin, amphotericin B.
b. Xử lý van tim trước bảo quản
- Rửa van tim nhiều lần bằng dung dịch nƣớc muối đẳng trƣơng
- Ngâm van trong dung dịch RPMI 1640 có bổ sung hỗn hợp kháng sinh vancomycin 50 µg/ml, amikacin 100 µg/ml, amphotericin B 20 µg/ml ở 4oC trong 24 tiếng. Mức dịch đảm bảo ngập tồn bộ mơ.
- Rửa lại mô bằng nƣớc muối đẳng trƣơng lạnh vô khuẩn
c. Kiểm tra độ vô khuẩn van tim trước khi đưa vào bảo quản
Xét nghiệm vi sinh mẫu bằng cách cấy trên thạch máu tìm vi khuẩn, nấm.
d. Đưa vào mơi trường chứa chất bảo quản
Van tim sau khi xử lý đƣợc thả vào dung dịch bảo quản lạnh bao gồm: môi trƣờng RPMI 1640 lạnh 4oC có bổ sung hỗn hợp kháng sinh penicilin 10.000UI/ml, streptomycin 10.000 µg/ml, Amphotericin B 0,125 µg/ml và DMSO là chất bảo vệ lạnh, bổ sung thêm 10% FBS. Việc bổ sung DMSO vào dung dịch bảo quản lạnh đƣợc tiến hành qua 4 bƣớc với nồng độ tăng dần: 2,5%, 5%, 7,5%, 10%. Mỗi nồng độ lƣu trong thời gian 5 phút. Tổng thời gian mô ủ với dung dịch bảo quản lạnh ở điều kiện 4oC là 20 phút.
Toàn bộ van tim và chất bảo quản đƣợc chứa trong túi nhựa, bên ngoài là túi thiếc. Mô van tim phải nằm giữa dung dịch bảo quản, không đƣợc chạm vào thành túi.
e. Hạ nhiệt độ theo chương trình
Đƣa túi chứa van tim và dung dịch bảo quản vào máy hạ nhiệt độ theo chƣơng trình. Tốc độ hạ nhiệt trung bình -1oC/phút tới nhiệt độ của thiết bị bảo quản.
f. Bảo quản lạnh sâu van tim
Đƣa túi chứa van tim và dung dịch bảo quản sau khi hạ nhiệt độ vào bảo quản lâu dài tại mức nhiệt độ: -80 oC bằng máy lạnh cơ học. (tủ lạnh sâu).
Theo dõi sự ổn định của nhiệt độ trên bảng tự động cài sẵn.
g. Rã đông van tim
Định kỳ sau 3 tháng, 6 tháng, mô đƣợc rã đông để đánh giá chất lƣợng. Sử dụng kỹ thuật rã đông nhanh bằng cách: Mô bảo quản lấy ra khỏi hơi nitơ đƣợc dìm trong bể nƣớc điều nhiệt đƣợc duy trì 37oC cho tới khi tan đá hồn tồn.
- Mô sau khi đã rã đông sẽ đƣợc loại bỏ dung dịch bảo quản lạnh chứa chất bảo vệ lạnh bằng cách rửa trong các dung dich có nồng độ DMSO giảm dần (7,5%, 5%, 2,5% và 0 %). Mỗi nồng độ rửa trong 5 phút. Tổng thời gian để loại bỏ DMSO là 20 phút.