A, C, E: nhóm chứng; B, D, F: nhóm bảo quản 6 tháng. A, B: mẫu nhuộm H.E độ phóng đại 100x;
C, D: mẫu nhuộm H.E độ phóng đại 250x; E, F: mẫu nhuộm Masson độ phóng đại 500x. A B F E D C
Quan sát hình ảnh vi thể mơ van tim sau bảo quản 6 tháng trong mơi trƣờng có FBS (hình 3.3) chúng tôi thấy cấu trúc mô van tim sau bảo quản nguyên vẹn, không đứt, gãy. Lớp tế bào nội mô (mũi tên đen) liên tục, không bong tách (18/20 mẫu). Các nguyên bào sợi (mũi tên xanh) số lƣợng nhiều, phân bố thƣờng xuyên rộng khắp mô van tim (18/20 mẫu). Không thấy biểu hiện phù nề mô kẽ (17/20 mẫu). Các sợi collagen (mũi tên đỏ) mềm mại và liên tục, xếp song song với nhau (17/20 mẫu).
Bảng 3.5. Tổng hợp kết quả quan sát cấu trúc vi thể van tim của các nhóm nghiên cứu trên tiêu bản nhuộm H.E và nhuộm Masson.
Nhóm Chỉ tiêu
Nhóm chứng
Bảo quản sau
3 tháng Bảo quản sau 6 tháng
Sự sắp xếp lớp tế bào nội mô liên tục
+ (5/5 mẫu) + (20/20 mẫu) + (18/20 mẫu) Mật độ phân bố của nguyên bào sợi.
+++ (5/5 mẫu) +++ (19/20 mẫu) +++ (18/20 mẫu) Có phù nề mơ kẽ - (5/5 mẫu) - (18/20 mẫu) - (17/20 mẫu) Sợi collagen liên tục,
mềm mại + (5/5 mẫu) + (18/20 mẫu) + (17/20 mẫu)
Kết quả tổng hợp các mẫu nghiên cứu ở các nhóm cho thấy, các mẫu mơ van tim sau bảo quản 3 tháng đều giữ đƣợc các tiêu chí: sự tồn vẹn mơ van tim, sự liên tục của lớp tế bào nội mô, số lƣợng và sự phân bố của nguyên bào sợi, khơng thấy hình ảnh phù nề mơ kẽ, sợi collagen mềm mại, liên tục.
Các mẫu mô van tim sau bảo quản lạnh sâu 6 tháng vẫn giữ đƣợc sự tồn vẹn mơ van tim so với các mẫu mô van tim tƣơi. Lớp tế bào nội mô sắp
xếp liên tục, khơng có sự xuất hiện phù nề mơ kẽ. Mật độ ngun bào sợi có tƣơng đối giảm, nhƣng vẫn ở mức trung bình, phân bố đều khắp mơ van tim. Các sợi collagen vẫn mềm mại, liên tục và song song với nhau.
Kết quả này của chúng tôi cũng tƣơng đồng với nhiều tác giả nhƣ Armiger (1985), Yanka (1987), Quintana (2009), Dƣơng Công Nguyên (2017) đều cho thấy cấu trúc vi thể của mô van tim vẫn đảm bảo sau bảo quản lạnh sâu [2]. Các chỉ tiêu về hình thái vi thể mơ van tim: sự sắp xếp lớp tế bào nội mô liên tục, mật độ phân bố của nguyên bào sợi, sự phù nề mô kẽ, sắp xếp các sợi sollagen không bị ảnh hƣởng nhiều trong q trình bảo quản. Điều đó cho thấy, chất lƣợng bảo quản về cấu trúc vi thể theo quy tình chúng tơi áp dụng khá tốt, đạt đƣợc các chỉ tiêu đề ra.
Chúng tơi có quan sát thấy một vài khoảng trắng trên 1 vài tiêu bản vi thể, đó có thể do sự hình thành tinh thể đá làm cho mô kẽ bị phù nề, tuy nhiên chúng tôi cũng quan sát thấy các khoảng trắng tồn tại trên cả mẫu van chứng khơng bảo quản, nhƣ vậy khơng có sự khác nhau về mặt vi thể giữa các nhóm bảo quản và nhóm chứng. Sự quan sát này của chúng tơi cũng đƣợc phân tích trên nghiên cứu của Kelvin G.M (2011), tác giả cũng chỉ ra các khoảng trắng xuất hiện trên các tiêu bản vi thể nhóm bảo quản và nhóm van chứng khơng bảo quản [38]. 3.2.3. Hình thái siêu vi thể col * col col col NBS col A B
Hình 3.4. Hình ảnh hiển vi điện tử truyền qua của van tim sau bảo quản 3 tháng. Hình A, hình B độ phóng đại 2890 lần;
hình C độ phóng đại 11560 lần.
Hình 3.5. Hình ảnh hiển vi điện tử truyền qua của van tim sau bảo quản 6 tháng, độ phóng đại 2900 lần.
Nhƣ kết quả chúng tôi đã nêu ở trên, về mặt cấu trúc vi thể với 2 phƣơng pháp nhuộm tiêu bản thông thƣờng là H.E và Masson mô van tim sau
col col * * * * NBS col C
bảo quản lạnh sâu khơng có nhiều sự thay đổi so với mơ van tim chứng. Tuy nhiên để đánh giá chi tiết hơn chất lƣợng mô van tim sau bảo quản, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp làm tiêu bản hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và tiêu bản nhuộm sống chết Trypan Blue. Với việc quan sát tiêu bản hiển vi điện tử xuyên, chúng tôi đánh giá kỹ hơn thành phần ngoại bào gồm các sợi collagen và sợi chun, thêm nữa cấu trúc hình thái tế bào của nguyên bào sợi cũng đƣợc đánh giá chi tiết. Phƣơng pháp nhuộm tiêu bản Trypan Blue giúp xác định tỷ lệ sống chết của nguyên bào sợi sau bảo quản.
Quan sát trên hình ảnh siêu vi thể nhóm bảo quản 3 tháng (hình 3.4) với hình A và hình B ta thấy nguyên bào sợi (NBS) có cấu trúc nhân bình thƣờng, màng nhân rõ, chất nhân phân bố khơng đồng đều. Các bó sợi collagen (col) cắt ngang hƣớng vng góc với bề mặt và cắt dọc chạy song song với nhau. Các sợi chun (*) xen kẽ các bó collagen (có đậm độ điện tử cao đồng đều). Mật độ chất nền ngoại bào thƣa, bào tƣơng sáng, các bào quan thấy rõ. Màng tế bào có đơi chỗ đứt đoạn (mũi tên đỏ). Hình C là hình ảnh phóng đại cấu trúc các xơ collagen, chúng ta có thể quan sát thấy rõ cả các vân ngang của chúng.
Ở nhóm bảo quản 6 tháng (hình 3.5), ngun bào sợi (NBS) có cấu trúc nhân bình thƣờng, chất nhân phân bố đồng đều. Các bó sợi collagen cắt ngang hƣớng vng góc với bề mặt (col). Các sợi chun (*) xen kẽ các bó collagen (có đậm độ điện tử cao đồng đều). Mật độ chất nền ngoại bào thƣa, bào tƣơng sáng, các bào quan thấy rõ. Màng tế bào nhiều vị trí đứt đoạn (mũi tên đỏ).
Kết quả trên kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) cho thấy các nhóm van tim bảo quản lạnh sâu 3 tháng và 6 tháng vẫn giữ đƣợc những thuộc tính cơ bản về thành phần ngoại bào. Chất nền ngoại bào lớp giữa lá van có cấu trúc dày đặc, tƣơng đối đồng nhất đƣợc tạo bởi các bó, dải collagen lớn xen kẽ với các sợi chun lớn. Các bó sợi collagen và sợi chun xuất hiện trên tất cả các lát
cắt, trên một số lát cắt cịn có thể thấy đƣợc các vân ngang của sợi collagen. Nguyên bào sợi nằm rải rác có cấu trúc tƣơng đối bình thƣờng, nhân co nhẹ chất nhân phân bố không đều, tập trung thành đám tăng đậm độ điện tử ở mặt trong màng trong nhân, màng nhân có cấu trúc hai lớp đồng đều, bào tƣơng sáng, lƣới nội bào có hạt dãn nhẹ. Các ngun bào sợi có tổn thƣơng khơng đồng đều từ bình thƣờng đến phá hủy hồn tồn, chủ yếu do q trình tự hủy sau chết.
Những tổn thƣơng về nguyên bào sợi có thể do chất bảo quản không thâm nhập đƣợc vào bên trong lá van nhƣ đã nói ở trên, gây nên sự hình thành các tinh thể đá ở ngồi tế bào, do đó lá van bị tổn thƣơng qua q trình đơng lạnh và rã đơng sau thời gian bảo quan dài. Những tổn thƣơng này có thể gây ảnh hƣởng đến các chức năng cơ – sinh học của van tim bảo quản lạnh sâu và cần có những đánh giá chi tiết hơn nữa [72]. Mặt khác, việc đánh giá hình thái qua tiêu bản siêu cấu trúc hiển vi điện tử xuyên cũng tồn tại một số nhƣợc điểm nhƣ đòi hỏi nhiều phép xử lý mẫu phức tạp cần phải phá hủy mẫu, việc điều khiển TEM rất phức tạp và đòi hỏi nhiều bƣớc thực hiện chính xác cao, cần phải cắt rất nhiều lát cắt để có thể đánh giá chính xác về những tổn thƣơng của tế bào.
Những biến đổi về cấu trúc ngoai bào về thành phần sợi chun và collagen của chúng tôi cho kết quả tƣơng tự với nghiên cứu của Amiger (1985) về hình thái mơ van tim sau bảo quản lạnh sâu tại các thời điểm từ 23 đến 380 ngày cho thấy các thành phần cấu trúc ngoại bào: sợi collagen, sợi chun ít chịu ảnh hƣởng của thời gian bảo quản. Tác giả khẳng định cấu trúc các thành phần này vẫn đảm bảo tốt sau thời gian bảo quản lên tới 380 ngày [7].
Kết quả này cũng tƣơng tự với Schenke-Layland, K (2006) nghiên cứu tác động của bảo quản lạnh sâu lên các cấu trúc ngoại bào lá van tim thấy rằng cấu trúc vi thể của các thành phần này khơng có nhiều ảnh hƣởng. Tuy
nhiên, bằng phƣơng pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch (các kháng thể kháng lại collagen typ I, III, IV và elastin) và phân tích hình ảnh bằng huỳnh quang đa phổ, tác giả nhận thấy có một sự tổn thƣơng đáng kể, suy giảm lên cấu trúc sợi collagen và sợi chun. Tác giả đƣa khuyến nghị cần thêm những nghiên cứu đánh giá chi tiết hơn những bất lợi về mặt sinh học cũng nhƣ trên lâm sàng về những ảnh hƣởng này, ngồi ra cần tối ƣu hóa các bƣớc trong phƣơng pháp bảo quản lạnh sâu thông thƣờng hay thử nghiệm bằng phƣơng pháp bảo quản mới nhƣ thủy tinh hóa [72].
Năm 2007, Schenke - Layland, K tiếp tục nghiên cứu việc tối ƣu hóa bảo quản van tim lên cấu trúc ngoại bào, tác giả cũng thử nghiệm bảo quản bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa. Một lần nữa tác giả khẳng định những tác động của phƣơng pháp bảo quản lạnh sâu thông thƣờng là khó tránh khỏi, mặc dù phƣơng pháp thủy tinh có thể làm độ bền lá van cao hơn hoặc ít suy van hơn nhƣng cần đánh giá chi tiết và cụ thể hơn nữa [73].
Kết quả quan sát hình thái siêu vi thể lá van tim của chúng tôi tƣơng tự nhƣ Amiger (1985) nghiên cứu trên 16 van tim từ ngƣời cho chết não đƣợc bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng cho thấy hình thái siêu vi thể của nguyên bào sợi thay đổi rất khác nhau, các tổn thƣơng có thể gặp ở các mức độ, đặc biệt là sau thời gian bảo quản dài ngày. Hình ảnh siêu vi thể nguyên bào sợi sau bảo quản 1 năm cho thấy nhân teo, nhân đông tăng đậm độ điện tử, màng nhân bị tách, xuất hiện khoảng sáng quanh nhân, bào tƣơng không rõ, mất màng tế bào, các bào quan tổn tƣơng mất màng, dãn rộng. Các ti thể mất mào, khơng cịn cấu trúc bình thƣờng [7].
Tuy nhiên bằng rất nhiều các phƣơng pháp đánh giá trực tiếp khả năng sống của nguyên bào sợi ngày càng chính xác và thuận tiện [34, 35] thì việc sử dụng hình thái siêu vi thể phân tích và đánh giá khả năng sống, sự tổn
thƣơng của nguyên bào sợi sau bảo quản tỏ ra kém ƣu thể và chỉ nhằm mục đích bổ sung hơn về vấn đề này.
3.2.4. Chất lƣợng sống tế bào mơ van tim
Hình 3.6. Hình ảnh nhuộm Trypan Blue ngun bào sợi mơ van tim trước và sau bảo quản với độ phóng đại 300 lần.
A: van tim chứng dương (không bảo quản); B: van tim chứng âm (tế bào đã chết); C: bảo quản sau 3 tháng; D: van bảo quản sau 6 tháng. Bảng 3.6. Kết quả tỷ lệ sống của nguyên bào sợi mô van tim ở các nhóm
bảo quản lạnh sâu
Kết quả
Nhóm bảo quản Tỷ lệ sống (%) Số mẫu p
Bảo quản 3 tháng 40,5 ± 0,7 10 p > 0,05 Bảo quản 6 tháng 40 ± 0,5 10 A D B C
Khả năng sống của tế bào van tim sau bảo quản là yếu tố liên quan trực tiếp đến tuổi thọ van tim sau ghép, trong đó nguyên bào sợi và tế bào nội mô là 2 loại tế bào quan trọng nhất. Các nghiên cứu trên thế giới chủ yếu tập trung đánh giá khả năng sống của nguyên bào sợi – loại tế bào đóng vai trị sản xuất collagen, duy trì cấu trúc ngoại bào có vai trị quyết định đến tuổi thọ của van sau ghép [78]. Có rất nhiều phƣơng pháp đƣợc sử dụng để đánh giá khả năng sống của nguyên bào sợi nhƣ: nuôi cấy nguyên bào sợi và đánh giá mức độ tăng sinh; phân lập nguyên bào sợi và nhuộm tiêu bản đánh giá sống chết tế bào; phƣơng pháp đo dòng chảy tế bào; hoặc có thể đánh giá gián tiếp qua khả năng sản xuất collagen [34, 35]. Vì những điều kiện có hạn và phạm vi của đề tài, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp đánh giá khả năng sống của tế bào bằng cách phân lập tế bào và nhuộm Trypan Blue. Quy trình tách tế bào của chúng tơi đƣợc thực hiện 2 bƣớc, trong đó bƣớc đầu là loại bỏ các tế bào nội mô. Trypan blue đƣợc tổng hợp lần đầu tiên bởi nhà khoa học ngƣời Đức Paul Ehrlich năm 1904. Trypan blue là thuốc nhuộm axit màu xanh có chứa hai nhóm chức azo loại bỏ bởi hầu hết các tế bào sống. Các tế bào sống, sẽ không cho thuốc nhuộm vào trong tế bào, ngƣợc lại tế bào chết có thể thấm và bắt màu thuốc nhuộm có màu xanh (hình 3.6).
Bằng việc tính tỷ lệ sống của nguyên bào sợi trên từng mẫu của nhóm nghiên cứu sau đó lấy giá trị trung bình đại diện của nhóm nghiên cứu, chúng có đƣợc tỷ lệ sống của nguyên bào sợi mơ van tim ở nhóm bảo quản sau 3 tháng là 40,5 ± 0,7%; tỷ lệ sống của nguyên bào sợi mơ van tim ở nhóm bảo quản sau 6 tháng là 40 ± 0,5%, khơng có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 giữa tỷ lệ sống nguyên bào sợi giữa 2 nhóm bảo quản 3 tháng và 6 tháng (bảng 3.6).
Kết quả của chúng tôi cũng khá tƣơng đồng với Niwaya K (1993) với tỷ lệ sống nguyên bào sợi sau bảo quản 2 tháng là 50,3 ± 3,7%, khi tác giả cũng
sử dụng tốc độ hạ nhiệt độ là -1°C/phút đến -80°C và sử dụng DMSO là chất bảo vệ lạnh với tỷ lệ 10% [59].
I Kashima (1999) bằng phƣơng pháp đo dòng chảy tế bào đánh giá khả năng sống của nguyên bào sợi sau bảo quản lạnh sâu (-80°C) cho tỷ lệ sống là 12,8 ± 1,4% với thời gian bảo quản 12 tuần. Kết quả này thấp hơn hẳn kết quả của chúng tơi có thể do tác giả đã sử dụng tốc độ làm lạnh là -1°C/phút từ 4°C đến - 40°C và - 5°C/phút từ -40°C đến -80°C [35]. Nhiều tác giả và ngân hàng mô van tim trên thế giới đã thống nhất tốc độ làm lạnh -1°C/phút là phù hợp với việc bảo quản mô van tim và tốc độ làm lạnh lớn hơn -1°C/phút sẽ làm giảm khả năng sống của nguyên bào sợi [29].
Rendal Vázquez (2004) nghiên cứu khả năng sống của tế bào mô van tim mà cụ thể là nguyên bào sợi sau bảo quản lạnh sâu với phƣơng pháp đo dòng chảy tế bào cho kết quả khoảng 56% nguyên bào sợi sống sau thời gian bảo quản là 1 tuần. Sự khác biệt này do 40 mẫu van tim lợn của tác giả đƣợc lấy với khoảng thời gian thiếu máu nóng là 1 giờ - tức là rất nhanh sau khi tim ngừng đập, lúc này sự tác động của các yếu tố nhƣ vi khuẩn, thiếu oxy, các độc tố sinh ra do rối loạn chuyển hóa... chƣa ảnh hƣởng nhiều. Mặt khác thời gian đánh giá khả năng sống nguyên bào sợi của tác giả là 1 tuần sau bảo quản, nhỏ hơn nhiều so với mốc 3 tháng và 6 tháng của chúng tôi. Thêm nữa việc xác định sống chết của nguyên bào sợi bằng phƣơng pháp đo dịng chảy tế bào có độ nhạy cao hơn hẳn so với phƣơng pháp nhuộm Trypan Blue của chúng tôi, với phƣơng pháp này các nguyên bào sợi chết hay sống đƣợc xác định 1 cách chính xác và tính chính xác đƣợc xác định trên cả tổng tất cả các tế bào có đƣợc trong mẫu nghiên cứu; ngoài ra khi đọc kết quả sống chết tế bào trên tiêu bản nhuộm Trypan Blue cần phải tiến hành nhanh vi thời gian càng lâu tê bào sẽ chết càng nhiều làm sai lệch kết quả nghiên cứu [34].
Nghiên cứu của Suh H (1999) đánh giá khả năng sống nguyên bào sợi theo phƣơng pháp nhuộm Trypan Blue cho kết quả 55,9 ± 7,9% nguyên bào sợi sống sau thời gian bảo quản 36 giờ [78].
Nhƣ vậy, bằng cả việc đánh giá cấu trúc đại thể, vi thể, siêu vi thể và tỷ lệ sống của nguyên bào sợi mô van tim, chúng tơi nhận thấy tình trạng mơ van tim sau bảo quản tại Lab. Bảo quản mô – Đại học Y Hà Nội với các khoảng thời gian 3 tháng và 6 tháng đều cho kết quả khá tốt so với mẫu chứng tƣơi và phù hợp với kết quả bảo quản của các ngân hàng mô khác trên thế giới.