* Các bước cấy chuyển được thực hiện lần lượt như sau
Sau khi hút bỏ hồn tồn mơi trƣờng cũ trong đĩa nuôi, rửa tế bào từ 2- 3 lần bằng PBS 1X; Bổ sung một lƣợng trypsin 0,25% - EDTA 1mM thích hợp vào đĩa ni (1ml với đĩa 60x15 mm; 1,5ml với đĩa 90x20 mm); nghiêng nhẹ đĩa đảm bảo cho trypsin đƣợc trải đều ra toàn bộ bề mặt đĩa.
Ủ đĩa nuôi ở 370C trong 2-3 phút, trong giai đoạn này, quan sát sự bóc tách tế bào sử dụng kính hiển vi soi ngƣợc (từ phút thứ 2, khoảng 20-30s một lần, cho tới khi >90% tế bào tách khỏi bề mặt đĩa và tạo thành tế bào đơn hình trịn trơi nổi trong dung dịch); Bổ sung một lƣợng mơi trƣờng ni cấy có FBS (gấp 2-3 lần lƣợng thể tích trypsin) để ức chế trypsin, trộn nhẹ nhàng;
Tiếp theo đ , toàn bộ huyền phù tế bào đƣợc chuyển vào ống ly tâm, ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 5 phút với tốc độ 1500 vòng/phút; Lƣu ý, tốc độ ly tâm có thể thay đổi phụ thuộc chất lƣợng tế bào, tốc độ 1500 vịng/phút thích hợp khi số lƣợng tế bào chiếm 80% bề mặt đĩa nuôi, tế bào sáng rõ.
Sau khi ly tâm, giữ cặn tế bào, bổ sung 1ml môi trƣờng mới, tái huyền phù tế bào và chuyển vào đĩa nuôi theo các tỷ lệ nhất định phụ thuộc vào mục đích của từng thí nghiệm, cụ thể:
+ Để ni ổn định hoặc duy trì tế bào: cấy chuyển sang đĩa mới cùng loại với tỷ lệ 1/3 hoặc 1/4;
+ Để quan sát và chụp ảnh hình thái tế bào trong mơ hình: cấy chuyển trên đĩa 24 giếng với mật độ 30.000 –50.000 tế bào/giếng;
+ Để xác định tỷ lệ tế bào sống và các thơng số ty thể khi thử mơ hình: cấy chuyển trên đĩa 96 giếng với mật độ 5000 – 10.000 tế bào/giếng.
Vệ sinh đĩa và giữ đĩa trong tủ nuôi.
Cấy chuyển (subculturing hay passing) là quá trình loại bỏ môi trƣờng cũ, chuyển tế bào sang môi trƣờng nuôi cấy mới, nhằm cung cấp thêm các chất dinh dƣỡng và không gian cho tế bào phát triển [36]. Sự sinh trƣởng của tế bào bắt đầu từ pha tiềm phát cho tới pha lũy thừa, trong giai đoạn này, số lƣợng tế bào tăng theo cấp số nhân. Khi các tế bào bám dính phủ hết bề mặt đĩa nuôi cấy hoặc khi các chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng nuôi cấy cạn kiệt, sự sinh trƣởng của tế bào giảm đáng kể hoặc chấm dứt hoàn toàn. Để giữ chúng ở mật độ tối ƣu cho sự tăng trƣởng liên tục cũng nhƣ kích thích sự tăng trƣởng của tế bào mạnh hơn, tế bào cần phải đƣợc cấy chuyển.
Trong nghiên cứu này, để đảm bảo chất lƣợng tế bào cho các thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi quan sát sự phát triển của tế bào bám dính trên bề mặt đĩa sau 24h - 120h nhằm đánh giá sự cấy chuyển thành công và khả năng sinh trƣởng tế bào theo thời gian. Kết quả cho thấy:
Khi mới cấy chuyển, tế bào ở dạng thể cầu, lơ lửng trong môi trƣờng nuôi; Ngày đầu tiên sau khi cấy chuyển (24h), tỷ lệ tế bào bám dính, phát triển chiếm khoảng 60-70%, kích thƣớc tế bào cịn nhỏ và cịn có dạng hơi cầu và chƣa bám dính lan tỏa nhiều (Hình 3.5A);
Trong những ngày tiếp theo, từ ngày thứ hai (48h) và ngày thứ ba (72h) tế bào phát triển mạnh và đạt tỷ lệ cao nhất ở ngày thứ tƣ (96h) (Hình 3.5 B-D). Tế bào trong giai đoạn này c độ bóng, có gờ mép bám đáy rõ ràng thể hiện khả năng bám dính tốt và chất lƣợng tế bào khỏe mạnh.
Tuy nhiên, khi tiếp tục kéo dài thời gian nuôi đến 120h và 144h, số lƣợng tế bào trong đĩa ni giảm, kèm theo hình dạng tế bào thay đổi, co cụm. Nguyên nhân là do chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng cạn kiệt và khoảng không gian trong đĩa nuôi bị thu hẹp, nên không cung cấp đủ chất dinh dƣỡng và không gian cho các tế bào sinh trƣởng và bám dính tốt. Điều này dẫn đến tế bào H9C2 chết hoặc/và co cụm lại (đĩa nuôi ở pha suy vong).
Do vậy, để đảm bảo các tế bào đủ tiêu chuẩn tham gia các thí nghiệm tiếp theo, việc cấy chuyển tế bào H9C2 nên đƣợc thực hiện sau 3-4 ngày từ lần cấy chuyển trƣớc đ (hoặc khi mật độ tế bào đạt khoảng 80% bề mặt đĩa nuôi).
3.1.3. Bảo quản tế bào H9C2
Một điểm thuận lợi trong nghiên cứu sử dụng dòng tế bào ổn định (stable cell line) là tế bào sẽ có thể đƣợc sử dụng và bảo quản tùy thuộc vào mục đích và các giai đoạn nghiên cứu khác nhau [34]. Mỗi dòng tế bào c đƣợc trong phịng thí nghiệm là một tài nguyên quan trọng, việc thay thế nó là rất tốn kém cũng nhƣ mất nhiều thời gian. Hơn nữa, số thế hệ nhân dòng của các dịng tế bào là khơng giống nhau và thƣờng có giới hạn. Bên cạnh đ , các dịng tế bào đƣợc ni cấy liên tục có
Hình 3.1. Ảnh đại diện ghi nhận sự phát triển của tế bào sau khi cấy chuyển tại các một số mốc thời gian. A) 24h; B) 48h; C) 72 h, D) 96h;E) 120h; F) 144h.
thể bị biến đổi gen hoặc gặp một số rủi ro nhƣ nhiễm khuẩn, trang thiết bị phịng thí nghiệm. Do vậy, đơng lạnh và lƣu trữ tế bào dịng lâu dài là một công đoạn rất quan trọng. Phƣơng pháp tốt nhất để bảo quản tế bào nuôi cấy là bảo quản chúng trong nitơ lỏng trong môi trƣờng hồn chỉnh với sự có mặt của chất bảo vệ lạnh nhƣ dimethylsulfoxide (DMSO). Chất bảo quản lạnh làm giảm điểm đ ng băng của môi trƣờng và cũng cho phép tốc độ làm lạnh chậm hơn, giảm đáng kể nguy cơ hình thành tinh thể băng, c thể làm tổn thƣơng và gây chết tế bào [36]. Các bƣớc tiến hành bảo quản tế bào H9C2 trong nghiên cứu này đƣợc thể hiện trên Hình 3.6.