Thành phần Gel tách (µl) Gel co (µl) H2O 1940 1180 Dung dịch A 1500 0 Dung dịch B 0 500 Dung dịch C 2500 300 SDS 10% 60 20 Ammonium persulfate 10% 24 10 TEMED 7 5 Tổng 6031 2015
Quy trình: Bản gel được đổ hai lớp, lớp dưới là gel tách được đổ cách mặt trên
1,5 cm, để đông 30 phút, cài lược rồi đổ tiếp lớp gel cô ở trên, để 30 phút cho gel đơng hồn tồn và ổn định. Thành phần gel như bảng 2.5.
Biến tính protein: 20 µl mẫu điện di được trộn với 5 µl đệm 5x tra mẫu protein,
spin khoảng 5 giây rồi biến tính ở 95°C trong 10 phút, sau đó lập tức cho ra 4°C.
Điện di: Bản điện di được lắp vào hệ thống điện di, đổ ngập bản điện di bằng đệm điện di protein. Mỗi giếng trên bản điện di được tra 20 µl mẫu protein đã biến tính và chạy với cường độ dịng điện 20 mA cho lớp gel cơ và 30 mA cho lớp gel tách trong vòng 45 phút. Sau điện di, bản gel được tách khỏi phiến kính rồi nhuộm bằng coomassie brilliant blue hoặc bằng bạc.
Nhuộm gel với coomassie brilliant blue: nhuộm bản gel với dung dịch nhuộm trong 1-2 giờ sau đó tẩy gel với dung dịch tẩy cho đến khi nhìn rõ các băng protein màu xanh.
Nhuộm gel bằng bạc: Cho 100 ml dung dịch 1 (50% (v/v) methanol, 5% (v/v) acetic acid, 50 µl formaldehyde), lắc trong 20 phút. Sau đó cho 100 ml dung dịch 2 (50% (v/v) methanol) trong 10 phút. Tiếp tục cho 100 ml nước cất trong 10 phút. Cho 100 ml dung dịch 3 (0,02% Na2S2O3) trong 1 phút. Sau đó cho 100 ml nước cất trong 1 phút. Cho 50 ml dung dịch 4 (0,05 g AgNO3) trong tối 20 phút. Rửa bằng nước cất trong 1 phút. Thực hiện phản ứng hiện màu bằng 100 ml dung dịch 5 (2% Na2CO3 + 50 μl formaldehyde) đến khi hiện băng. Cuối cùng, dừng phản ứng bằng dung dịch 6 (5% acid acetic).
Western blot
Nguyên lý: Western blot (cịn có cách gọi khác là blot miễn dịch) là phương
pháp phân tích sử dụng để phát hiện protein trên mẫu mô hay dịch chiết mô. Phương pháp này sử dụng điện di để phân tách protein cịn ngun vẹn hay đã biến tính theo độ dài của mạch polypeptide (trong điều kiện biến tính) hoặc bằng cấu trúc ba chiều của protein (khi còn nguyên vẹn hay khơng biến tính). Sau đó chuyển protein này lên màng (thường sử dụng là nitrocellulose hay PVDF), ở đó chúng được gắn (xác định) bằng kháng thể đặc hiệu với protein đích.
Quy trình: chạy điện di protein (SDS-PAGE), mỗi giếng trên bản điện di được
tra 7 µl mẫu SK tinh sạch đã biến tính, tương đương 1,25 µg SK/giếng. Sử dụng marker màu. Chuẩn bị các dung dịch: 1x đệm lai + methanol ở 4C; methanol ở
-20C, sữa gầy. Cắt màng PVDF có kích thước bằng bản gel, ngâm màng trong methanol lạnh trong 5 phút.
Ngâm bộ chuyển màng trong 1x đệm lai trong 5 phút. Bộ chuyển màng được sắp xếp theo thứ tự: (1) bản đen (-); (2) xốp; (3) giấy thấm; (4) gel; (5) PVDF; (6) giấy thấm; (7) xốp; (8) bản trắng (+). Chạy 100 V trong 2 h ở 4C.
Thu lại màng PVDF. Nhuộm màng bằng poncean trong 5 phút để kiểm tra protein đã được chuyển lên màng. Rửa màng ba lần bằng nước khử ion. Sau đó phủ màng bằng 5% sữa gầy trong 2 h hoặc qua đêm ở 4ºC. Rửa ba lần bằng 1x TTBS, mỗi lần lắc 5-10 phút, 50 rpm bằng máy lắc. Tiếp tục rửa tiếp ba lần bằng 1x TBS, mỗi lần lắc 5-10 phút.
Kháng thể 1 được pha loãng 1000 lần trong 25 ml 1% sữa gầy. Nhuộm màng bằng kháng thể 1 đã pha loãng, lắc trong 2-3 h. Rửa ba lần bằng 25 ml 1x TTBS, mỗi lần lắc 5-10 phút. Rửa tiếp ba lần bằng 25 ml 1x TBS, mỗi lần lắc 5-10 phút.
Kháng thể 2 (kháng kháng thể 1) được pha loãng tương tự kháng thể 1. Nhuộm màng bằng kháng thể 2 đã pha loãng, lắc trong 2-3 h. Rửa ba lần bằng 25 ml 1x TTBS, mỗi lần lắc 5-10 phút. Rửa tiếp ba lần bằng 25 ml 1x TBS, mỗi lần lắc 5-10 phút.
Thêm dung dịch hiện màu gồm ống 1: 25 ml 1x TBS + 15 µl H2O2 và ống 2: 5 ml methanol lạnh + 15 mg chất hiện màu. Trộn đều hai ống và nhuộm màng đến khi xuất hiện băng protein (khoảng 15-30 phút).
Chuẩn bị mẫu
300 ml dịch nuôi cấy được thu tại thời điểm xác định và được ly tâm 5000 rpm trong 10 phút để thu tế bào. Cặn tế bào được rửa bằng 10 ml đệm 50 mM KP, pH 7,5.
Tinh sạch protein tái tổ hợp
Nguyên lý: Protein biểu hiện dưới dạng thể vùi không tan trong đệm. Các protein
khác tan trong dịch được ly tâm để loại bỏ, cặn thu được là protein tinh sạch ở dạng thể vùi.
Qui trình: 2.5 mg cặn tế bào từ dịch ni biểu hiện mSK-nonhis được hịa trong
20 ml dung dịch đệm 50 mM KP, pH 7,5. Cặn tế bào được phá siêu âm 10 lần (mỗi lần 30 giây), ly tâm 12500 rpm trong 15 phút, thu cặn. Cặn thu được lại tiếp tục được hòa vào 20 ml đệm 50 mM KP và phá siêu âm như trên. Bước này được lặp lại khoảng 3-4 lần. Cặn cuối cùng được hòa lại vào 11 ml dung dịch 6 M guanidine để hòa tan protein thể vùi.
Hoạt hóa SK
Nguyên lý: SK biểu hiện trong E. coli JM109 ở dạng thể vùi. Để thu được protein hòa tan, SK hoạt động, các thể vùi phải được hịa tan sau đó được tái cuộn xoắn.
Quy trình: SK dạng thể vùi sau khi tinh sạch được hòa với 11 ml 6 M guanidne
để hòa tan thể vùi. Ly tâm 12500 rpm thu dịch trong (khoảng 11 ml).
5 µl SK tinh sạch đã hịa tan được pha lỗng 200 lần bằng 995 µl đệm 50 mM KP, pH 7,5. Bổ sung 0,5% Triton X-100 (+ 10% glycerol) hoặc 1% Tween 20 (+ 10% glycerol) hoặc 1,5% Tween 80 (+ 10% glycerol) và ủ 6 giờ ở 4°C rồi xác định hoạt tính.
Định lƣợng SK
Nguyên lý: hoạt độ SK được định lượng thông qua plasmin thủy giải cơ chất
N (p-tosyl) gly-pro-lys-4-nitro anilide acetate salt (AAS), và được phát hiện ở bước sóng 405 nm như đã mơ tả [26].
Tiến hành: phản ứng 1:10 μl protein trong đệm phosphate pH 7,5; 10 μl 20 mM
Tris-HCl (pH 7,5); 2 μl plasminogen người (0,025 U/μl). Hỗn hợp phản ứng 1 được ủ 30 phút ở 37°C.
Phản ứng 2: phản ứng màu được bắt đầu khi bổ sung 40 μl dung dịch 1 mM AAS. Sau 15 phút ủ ở 37°C, dừng phản ứng bằng 10 μl 0,4 N acetic acid, hỗn hợp phản ứng được đo phổ hấp phụ tại bước sóng 405 nm.
Xây dựng đƣờng nồng độ SK chuẩn
SK được hòa vào đệm 50 M tris-HCl, pH 7,5 với các nồng độ khác nhau từ 0 đến 30 U/ml. Môi trường được tạo ra như trong xác định hoạt độ, sau đó đo độ
hấp phụ tại bước sóng 405 nm. Độ hấp phụ và nồng độ SK chuẩn được xây dựng bằng chương trình excel [4] (hình 2.1).
Hình 2.1. Đường chuẩn SK.
Đường chuẩn có phương trình tuyến tính: y = 0,0553x – 0,3226. Trong đó: Y, độ hấp phụ (OD) ở bước sóng 405 nm.
X, nồng độ streptokinase (U/ml)
Xác định nồng độ protein
Nồng độ protein được xác định theo phương pháp Bradford.
Phương pháp này dựa trên nguyên lý: các protein khi phản ứng với coomassie brilliant blue sẽ hình thành phức hợp màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595 nm, cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong dung dịch [9]. Nồng độ protein được xác định dựa vào đồ thị chuẩn protein từ dung dịch albumin huyết thanh bị 1 mg/ml (hình 2.2).
Hình 2.2. Đường chuẩn Bradford.
Đường chuẩn có phương trình tuyến tính: y = 0,025x – 0,0169. Trong đó: Y, độ hấp phụ (OD) ở bước sóng 595 nm.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1.6 Nhân dịng gene mã hóa mSK-nonhis
Gene mã hóa streptokinase khơng mang đi 6xhis được khuếch đại từ khuôn DNA của S. pyogenes đã được Vũ Hồng Diệp tách chiết và tinh sạch trong nghiên cứu trước bằng cặp mồi mSKF và mSKR được thiết kế dựa trên trình tự gene sk đã được đăng kí (GenBank: EU872448). Sản phẩm PCR có một băng DNA khoảng 1,25 kb, phù hợp với kích thước tính tốn (hình 3.1).
Sản phẩm PCR được chèn vào vector nhân dịng pJET1.2/bunt, hình thành plasmid tái tổ hợp pJmSK và biến nạp vào E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt. Các khuẩn lạc được nuôi cấy để tách plasmid. Plasmid tái tổ hợp có kích thước lớn hơn pJET1.2 do đó có khả năng mang gene chèn (hình 3.1, giếng 2, 3).
Hình 3.1. Điện di đồ sản phẩm nhân gene msk-nonhis.
Sản phẩm PCR nhân gene msk-nonhis (1); plasmid nhân dòng pJmSK (2, 3); sản phẩm cắt pJmSK với NdeI và XhoI (4); ĐC: pJET1.2 ; M : marker
DNA ngoại lai được thiết kế hai điểm cắt NdeI và XhoI ở hai đầu. Sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng NdeI và XhoI cho một băng DNA tương ứng với kích thước của gene msk (1245 bp) và một băng tương ứng với kích thước của pJET1.2
(2974 bp) (hình 3.1, giếng 4). Như vậy gene msk đã được nhân dòng trong pJET1.2.
1 M 2 3 ĐC 1500 bp 1000 bp 3000 bp 4 M 1500 bp 1000 bp
1.7 Thiết kế plasmid biểu hiện mSK
Để tạo ra protein tái tổ hợp hồn chỉnh, khơng bị lẫn một số amino acid trong vùng đa nối của vector pET21a(+), gene msk được thiết kế chèn vào pET21a(+)
giữa vị trí của NdeI và XhoI.
Đoạn gene msk từ pJmSK và pET21a(+) sau khi cắt bằng NdeI và XhoI
(hình 3.2, giếng 2, 1) được tinh sạch (hình 3.2, giếng 4, 3) và nối ghép với nhau tạo thành plasmid tái tổ hợp pEmSK. pEmSK có kích thước lớn hơn đối chứng pET21a(+) (hình 3.2, giếng 5, 6) nên có khả năng mang gene chèn. Plasmid tái tổ hợp pEmSK sau đó được chọn dịng trong E. coli DH5α.
Hình 3.2. Điện di đồ DNA thiết kế vector biểu hiện pEmSK.
Sản phẩm cắt pET21a (+) (1) và pJmSK (2) bằng NdeI và XhoI; sản phẩm tinh sạch pET21a(+) (3) và msk-nonhis (4) sau khi cắt bằng NdeI và XhoI; plasmid pEmSK (5), pET21a (+) (6);
sản phẩm cắt pEmSK với NdeI và XhoI (7).
Plasmid tái tổ hợp pEmSK được cắt kiểm tra với NdeI và XhoI cho một băng có kích thước khoảng 5,5 kb tương ứng với pET21a(+) và một băng có kích thước khoảng 1,25 kb tương ứng với đoạn chèn. Như vậy gene msk đã được chèn vào
pET21a(+) (hình 3.2, giếng 7). Plasmid pEmSK sau đó được đọc trình tự để kiểm tra cấu trúc biểu hiện trước khi biểu hiện trong E. coli JM109(DE3).
Thông thường, các vector biểu hiện được thiết kế có gắn thêm 6 bộ ba mã hóa cho histidine và một bộ ba kết thúc nằm ngay sau 6xhis. Do đó protein tái tổ hợp được biểu hiện sẽ được gắn thêm đuôi 6xhis. Để loại bỏ việc tổng hợp đuôi 6xhis
1 M 2 3 4 M 5 6 7 M 1500 1500 5000 1000 1000 5000 5000 1500 3000 bp bp bp
trong quá trình biểu hiện mSK, một bộ ba kết thúc được thiết kế bổ sung ngay sau gene msk và trước đi 6xhis.
Hình 3.3. Peak trình tự pEmSK-nonhis.
Kết quả đọc trình tự pEmSK cho thấy có một bộ ba kết thúc TGA (1) ở trước điểm cắt XhoI và trước đi 6xhis như tính tốn (hình 3.3). Bộ ba kết thúc cũ TGA (2) của vector nằm sau đuôi 6xhis. Trong quá trình dịch mã, sự dịch mã sẽ kết thúc khi gặp bộ ba kết thúc thứ nhất, do đó protein tạo thành sẽ khơng mang đuôi 6xhis.
Sử dụng phần mềm DNAstar phân tích cho kết quả đoạn gene msk-nonhis có chiều dài 1245 bp, mã hóa cho protein gồm 414 amino acid, kích thước khoảng 47 kDa, có trình tự tương đồng 100% với gene mã hóa cho streptokinase (bỏ peptide tín hiệu) đã được đăng kí trong GenBank (EU 872448). Cấu trúc biểu hiện của pEmSK đã đúng khung đọc như tính tốn ban đầu (hình 3.4), đủ điều kiện để đưa vào biểu hiện trong E. coli JM109(DE3).
6xhistidine
XhoI
2 1
AGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAA 60 T7 promoter lac operator
TTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATatgattgctgga 120 NdeI I A G 3 cctgaatggctgctagaccgtccatctgtcaacaacagccaattagttgttagcgttgct 180 P E W L L D R P S V N N S Q L V V S V A 23 ggtactgttgaggggacgaatcaagaaattagccttaaattttttgaaattgacctaaca 240 G T V E G T N Q E I S L K F F E I D L T 43 tcaggacctgctcagggaggaaagacagagcaaggcttaagtccaaaatcaaaaccattt 300 S G P A Q G G K T E Q G L S P K S K P F 63 gctacaaataaaggcgcaatgccacataaacttgaaaaagctgacttattaaaggctatt 360 A T N K G A M P H K L E K A D L L K A I 83 caagaacaattgatcgctaacgttcacagtaacgacggctactttgaggtcattgatttt 420 Q E Q L I A N V H S N D G Y F E V I D F 103 gcaagcgatgcaaccattactgatcgaaacggcaaggtctactttgctgaccgagatgat 480 A S D A T I T D R N G K V Y F A D R D D 123 tcggtaaccttgccgacccaacctgtccaagaatttttgctaagcgggcatgtgcgcgtt 540 S V T L P T Q P V Q E F L L S G H V R V 143 agaccgtatcaacctaaagccgttcactactcagctgaacgcgttaacgtcaactatgaa 600 R P Y Q P K A V H Y S A E R V N V N Y E 163 gtgagctttgtctccgaaacaggagatttagactttacaccgttgttaagaaaccaatac 660 V S F V S E T G D L D F T P L L R N Q Y 183 catttgaccacactggcagttggtgactctctttcatcacaagagttagcagcgattgcc 720 H L T T L A V G D S L S S Q E L A A I A 203 caatttatcctatcaaaaaaatatccagattatatcattacaaaacgtgactcctcaatc 780 Q F I L S K K Y P D Y I I T K R D S S I 223 gtcactcatgacaatgacattttccgtacgattttaccaatggaacaagagtttacttac 840 V T H D N D I F R T I L P M E Q E F T Y 243 catatcaaagaccgggaacaagcttataaggccaattctaaaacaggtattgtagaaaaa 900 H I K D R E Q A Y K A N S K T G I V E K 263 acgaacaacactgaccttatctctgagaaatattacgtccttaaaaaaggggaaaagccg 960 T N N T D L I S E K Y Y V L K K G E K P 283 tatgatccctttgatcgcagtcacttgaaactgttcaccatcaattacgttgatgtcaac 1020 Y D P F D R S H L K L F T I N Y V D V N 303 accaacgaattgctaaaaagcgagcagctcttaacagctagcgaacgtaacttagacttc 1080 T N E L L K S E Q L L T A S E R N L D F 323 agagatttatacgatcctcgtgataaggctaaactactctacaacaatctcgatgctttt 1140 R D L Y D P R D K A K L L Y N N L D A F 343 ggtattatggactataccttaaccggaaaagtagaggataatcacaatgacaccaaccgt 1200 G I M D Y T L T G K V E D N H N D T N R 363 atcataaccgtttatatgggcaagcgacccgaaggagagaatgctagctatcatttagct 1260 I I T V Y M G K R P E G E N A S Y H L A 383 tatgataaagatcgttataccgaagaagaacgagaagtttacagctacctgcgttataca 1320 Y D K D R Y T E E E R E V Y S Y L R Y T 403 gggacacctatacctgataaccctaaagacaaatgactcgagcaccaccaccaccaccac 1380 G T P I P D N P K D K XhoI 6xhis 414 tgaGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAG 1440 Terminator CAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG 1494
1.8 Biểu hiện streptokinase nonhis
Sau khi cấu trúc biểu hiện đã kiểm tra đúng khung đọc, plasmid tái tổ hợp pEmSK được biến nạp vào E. coli JM109 DE3 tạo thành chủng JMpEmSK tái tổ hợp. Cặn tế bào JMpEmSK sau 6 giờ cảm ứng biểu hiện với 1 mM IPTG được thu và kiểm tra protein tổng số trên SDS-PAGE.
Hình 3.5. Điện di đồ protein tổng số của mẫu biểu hiện.
Protein tổng số của JM109(DE3) (1); JM109(DE3) mang pET21a(+) (2); JMpEmSK không cảm ứng bằng IPTG (3); JMpEmSK sau 6 h cảm ứng IPTG (4).
Kết quả điện di protein tổng số của tế bào trên hình 3.5 cho thấy, mẫu tế bào thu tại thời điểm 6 giờ sau cảm ứng bằng IPTG (làn 4) xuất hiện một băng đậm khác với mẫu không cảm ứng IPTG (làn 3) và có kích thước khoảng 47 kDa phù hợp với kích thước của mSK.
Hình 3.6. Phân tích năng suất protein biểu hiện tính bằng phần mềm Dolphin 1D.
M 1 2 3 4
45 55 kDa
Phân tích phần mềm Dolphin 1D cho thấy mSK biểu hiện chiếm khoảng 72% protein tổng số của tế bào (hình 3.6).
Kết quả biểu hiện này cao hơn so với cơng trình của Esrtrada et al. (1992) khi
biểu hiện gene sk trong E. coli W3110 năng suất chỉ đạt 25% protein tổng số. Reza
et al. (2007), sử dụng vector pGEX để biểu hiện SK trong E. coli cũng chỉ đạt năng
suất biểu hiện là 50% protein tổng số. Nguyễn Sỹ Lê Thanh (2010) sử dụng vector pET21a(+) biểu hiện mSK trong E. coli BL21 chỉ đạt 50% protein tổng số.
Xu hướng biểu hiện protein tái tổ hợp ở thể vùi trong tế bào E. coli khá phổ
biến. Kuppusamy et al. (2006) cũng đã cơng bố, theo đó 96% SK tái tổ hợp được
biểu hiện ở dạng thể vùi, chỉ 4% ở dạng hòa tan [38]. Kết quả tương tự cũng được Avilan et al. (1997) công bố [6]. Để xác định mSK-nonhis được biểu hiện nội bào ở dạng hòa tan hay thể vùi, tế bào được phá bằng siêu âm trong đệm K-phosphate, ly tâm thu dịch trong phía trên và cặn kiểm tra trên SDS-PAGE. Kết quả trên hình 3.7 cho thấy, mSK-nonhis được sinh tổng hợp chủ yếu dưới dạng thể vùi, đúng với kết quả biểu hiện của các tác giả đã cơng bố.
Hình 3.7. Điện di đồ protein dịch nổi và cặn.
Protein tổng số của tế bào JMpEmSK sau 6 h biểu hiện (1), dịch nổi sau ly tâm dịch siêu âm phá tế bào (2), cặn sau siêu âm phá tế bào (3), Marker (M).
M 1 2 3 kDa
45 35
1.9 Tinh sạch streptokinase nonhis
Protein mSK-nonhis chủ yếu được biểu hiện ở dạng thể vùi trong khi các protein khác phần lớn ở dạng thể tan nên mSK-nonhis có thể tinh sạch bằng phương pháp siêu âm nhiều lần để loại bỏ các protein hòa tan.
2,5 g tế bào tươi thu được sau 6 giờ biểu hiện ở 28°C trong môi trường LB bổ sung 1 mM IPTG được tinh sạch theo phương pháp phá siêu âm đã mô tả trong phần phương pháp. Độ sạch của mSK-nonhis được kiểm tra trên SDS-PAGE nhuộm bạc.
Hình 3.8. Điện di đồ protein tinh sạch.
Protein tổng số (giếng 1), dịch nổi sau siêu âm phá tế bào lần 1, 2, 3, 4 (giếng 2, 4, 6, 8), cặn sau siêu âm phá tế bào (giếng 3, 5, 7, 9); Marker (M).
Kết quả tinh sạch cho thấy sản phẩm cặn sau khi phá siêu âm lần thứ 4 hầu như chỉ có một băng có kích thước khoảng 47 kDa, tương đương với kích thước của mSK (hình 3.8, làn 9).
Cặn cuối cùng được hòa với guanidine để làm tan thể vùi. Hàm lượng protein qua các lần tinh sạch được xác định bằng phương pháp Bradford. Đồng thời đo hoạt độ của các mẫu tương ứng để xác định hiệu suất tinh sạch.
Hiệu suất thu hồi mSK-nonhis tinh sạch đạt 87% (bảng 3.1), tương đương với năng suất biểu hiện 0,78 mg mSK-nonhis/g tế bào. Hiệu suất thu hồi mSK-nonhis