(theo Daniala Beckmann, http://Flickriver.com)
Ở môi trường thạch máu, khuẩn lạc nhỏ trịn lồi, màu hơi xám, bóng hoặc mờ đục và khuẩn lạc lầy nhầy (hình 1.7).
Tính chất hóa học
S. pyogenes khơng có catalase, đặc biệt nhạy cảm với bacitralin. Liên cầu khuẩn
có cấu trúc kháng nguyên phức tạp. Vỏ nhầy ngoài cùng chứa acid hyaluronic, trong đó có cấu trúc hóa học giống mơ liên kết của vật chủ, khiến cho vật chủ không thể nhận dạng và do đó thốt khỏi sự thực bào của các bạch cầu trung tính và đại thực bào. Thành tế bào S. pyogenes rất đa dạng và phức tạp. Các thành phần kháng
nguyên của tế bào là các yếu tố độc lực. Các thành phần ngoại bào chịu trách nhiệm về quá trình sinh bệnh bao gồm invasins và ngoại độc tố. Lipoteichoic acid và protein M nằm xuyên màng qua thành tế bào và vỏ nhầy. Protein F là một fibronectin gắn với protein cho phép nó bám dính vào tế bào biểu mơ hơ hấp.
Streptokinsase là enzyme hoạt hóa plasminogen, có hoạt tính phân hủy fibrin, có vai trị quan trọng trong quá trình thâm nhập của vi khuẩn vào tế bào vật chủ.
1.3.4 Đặc điểm gây bệnh
S. pyogenes là một trong những tác nhân gây bệnh phổ biến nhất của con người.
Người ta ước tính có khoảng 5-15% người bình thường có vi khuẩn cư trú, thường là ở đường hô hấp nhưng không biểu hiện thành bệnh. S. pyogenes có thể lây nhiễm khi hệ thống bảo vệ bị tổn hại. Khi vi khuẩn được chuyển đến khu vực bị tổn thương sẽ làm xuất hiện một loạt các nhiễm trùng mủ.
S. pyogenes có khả năng xâm nhiễm và lây lan nhanh do nó có khả năng trốn tránh được đại thực bào và gây nhầm lẫn hệ thống miễn dịch. Những bệnh nhiễm trùng cấp tính liên quan đến S. pyogenes chủ yếu xảy ra ở đường hô hấp, máu và da.
Các nhiễm khuẩn tại chỗ: như viêm họng, viêm tị hầu, chốc lở, viêm quầng ở
người lớn, các nhiễm trùng vết thương.
Các nhiễm khuẩn thứ phát: như viêm màng trong tim cấp, sốt hậu sản hoặc nhiễm trùng huyết mà điểm xuất phát là từ da, tử cung hoặc vùng tị hầu.
Bệnh tinh hồng nhiệt: là một bệnh nhiễm trùng cấp tính của amidan hay nhiễm
trùng da, thường gặp ở trẻ em trên 2 tuổi ở các nước ôn đới. Sau 2-3 ngày bị nhiễm trùng ở họng thì người bệnh bị phát ban ở người nhưng quanh miệng lại có quầng trắng.
Các di chứng: đặc điểm của nhiễm liên cầu A là xuất hiện di chứng 2-3 tuần sau
bệnh liên cầu, đặc biệt là viêm họng. Di chứng có thể là viêm cầu thận cấp hoặc thấp khớp cấp.
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 1.4 Nguyên liệu và thiết bị
1.4.1 Tế bào và plasmid
DNA tổng số từ chủng Streptococcus pyogenes DT7 do Học viện Quân y và Cục thú y cung cấp đã được Vũ Hồng Diệp tách chiết trong nghiên cứu trước đây [5].
Hai chủng E. coli DH5α (Invitrogen, Mỹ) và E. coli JM109(DE3) (endA1, recA1, gyrA96, thi, hsdR17 (rk-, mk+), relA1, supE44, -, (lac-proAB), [F’,
traD36, proAB, lacIqZM15], IDE3) (Promega) được sử dụng để nhân dòng và biểu hiện mSK-nonhis.
Plasmid pJET1.2 và pET21a(+) dùng để nhân dòng và biểu hiện (bảng 2.1).
Bảng 2.1. Plasmid nhân dịng và biểu hiện.
Plasmid Đặc điểm chính Kích thƣớc (bp) Nguồn
pJET1.2/blunt T7 promoter, Ampr 2974 Fermentas
pET21a(+) T7 promoter, T7 terminater, N-terminal pelB signal sequence, C-terminal His Tag sequence, Ampr
5443 Invitrogen
Ampr: gene kháng ampicillin
1.4.2 Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết: agarose từ Rockland (Mỹ), acrylamide và bis-acrylamide, APS và TEMED, chloroform-isoamyl aclohol (24:1), ethidium bromide từ Merck (Đức), T4 ligase,
Taq polymerase, RNase, NdeI và XhoI từ Fermentas (Litva); mồi từ Bioneer (Hàn
Quốc), guanidine từ Research Organics (Mỹ); IPTG từ Biobasis (Canada); kit tinh sạch DNA từ Promega (Mỹ); N-(p-tosyl) gly-pro-lys-4-nitro anilinde acetate salt từ Sigma (Mỹ); plasminogen người từ Mpbio (Mỹ).
Kháng thể kháng SK (kháng thể 1) được tạo bằng cách tiêm dịch SK tái tổ hợp tinh sạch từ chủng E. coli BL21 (sau khi tinh sạch qua cột Ni2+ và nhận dạng bằng Maldi-top vào thỏ và thu huyết thanh, kháng thể IIg và SK chuẩn từ Sigma (Mỹ), BSA từ Promega (Mỹ).
1.4.3 Dung dịch và đệm
Các loại dung dịch và đệm dùng cho thí nghiệm được chuẩn bị theo bảng 2.2.
Bảng 2.2. Thành phần các loại đệm và dung dịch.
Dung dịch Thành phần, nồng độ
Sol I 50 mM glucose; 25 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8,0
Sol II 0,2 N NaOH, 1% SDS
Sol III 60% kali acetate, 11,5% acetic acid nguyên chất, 28,5% nước cất
Đệm TE 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0
Đệm 6x tra mẫu DNA 0,09% brommophenol blue, 0,09% xylene xyanol (FF), 60% glycerol
Đệm 10x TBE 20 mM EDTA, 900 mM Tris-borate, pH 8,0 Dung dịch nhuộm DNA 0,1 g/ml ethidium bromide
Dung dịch A Đệm 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 Dung dịch B Đệm 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8
Dung dịch C 30% acrylamide, 0,8% bis-acrylamide
Đệm 5x tra mẫu protein 0,05% brommophenol blue, 50% glycerol pha trong đệm 1 M Tris-HCl, pH 6,8
Đệm điện di protein 20 mM Tris-HCl, 192 mM glycine, 0,1% SDS, pH 8,8 Dung dịch nhuộm
PAGE
0,1% (w/v) coomassie brilliant blue, 30% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid
Dung dịch tẩy PAGE 30% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid Kháng thể 2 IIg pha loãng 10000 lần trong 5% sữa gầy Poncean 100 mg poncean; 100 ml 2% acetic acid Sữa gầy 5% sữa gầy pha trong dung dịch 1x TBS 10x đệm lai 30 g tris base; 144,13 g glycine, 1000 ml H2O 1x đệm lai + 100%
methanol
100 ml 10x đệm lai, 200 ml 100% methanol, 700 ml H2O 1x TBS 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, pH 7,5
1.4.4 Môi trường nuôi cấy
Môi trường LB (Luria-Bertani): 1% (w/v) peptone, 0,5% (w/v) cao nấm men,
1% (w/v) NaCl, pH 7,5. Môi trường rắn được bổ sung 2% (w/v) agar. Môi trường chọn lọc khuẩn lạc mang plasmid bổ sung 100 g/ml ampicillin.
1.4.5 Thiết bị thí nghiệm
Các thiết bị được sử dụng làm thí nghiệm thuộc phịng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam (bảng 2.3).
Bảng 2.3. Các thiết bị thí nghiệm.
Tên thiết bị Xuất xứ
Bể ổn nhiệt VS-1205CW Vision (Hàn Quốc)
Box cấy vi sinh vật Clean Bench TCV.02-1 (TTCG công nghệ) Việt Nam Box cấy vi sinh vật Laminar LB-1234
Cân phân tích BL150S Sartorius (Thụy sỹ)
Hệ thống chụp ảnh gel Dolphin-Doc CCD CAMERA 201 Wealtec (Đài Loan)
Hệ thống điện di đứng Biometra (Đức)
Máy đo pH-827 Metrohm (Thụy Sỹ)
Máy lắc ổn nhiệt ProvocellTM
Esco (Mỹ)
Máy li tâm lạnh CF16RXII Hettich (Đức)
Máy li tâm lạnh Hettich Mikro 22R Hitachi (Nhật)
Máy ni lắc Certomat® HK Sartorius (Đức)
Máy PCR Thermocycler Personal Eppendorf (Đức)
Máy quang phổ UV2500 Labomed (Mỹ)
Máy siêu âm phá tế bào Misonix S-4000-010 Microson (Mỹ)
Máy Vortex OSI Rotolab (Đức)
Nồi khử trùng ES-315 Tomy (Nhật)
Tủ lạnh 4C GR-N45VTV Toshiba (Nhật)
Tủ lạnh sâu -20C VCF-280 Deawoo
Tủ lạnh sâu -84C MDF-192 Sanyo (Nhật)
1.5 Phương pháp nghiên cứu
1.5.1 Các phương pháp vi sinh vật
Nuôi cấy E. coli
E. coli bảo quản ở -84C được cấy vạch lên đĩa thạch để hoạt hóa, ủ ở 37°C qua
đêm. Một khuẩn lạc riêng rẽ trên đĩa thạch được nuôi trong môi trường LB lỏng, lắc 200 rpm ở 37°C qua đêm. Các chủng tái tổ hợp được nuôi trong môi trường LB bổ sung 100 µg/ml ampicillin.
Ni biểu hiện
Chủng E. coli JM109(DE3) tái tổ hợp được nuôi cấy qua đêm ở 37C trong 5 ml mơi trường LB có bổ sung 100 µg/ml ampicillin. Sau đó tiếp giống 1% dịch giống sang bình 500 ml chứa 100 ml LB lỏng + 100 µg/ml ampicillin, ni lắc 37C trong 3 giờ để OD600 đạt 0,5-0,8. Bổ sung chất cảm ứng IPTG đến nồng độ cuối cùng là 1 mM và tiếp tục nuôi lắc 200 rpm ở 28C để cảm ứng tế bào biểu hiện protein tái tổ hợp. Sau 6 giờ nuôi cấy cảm ứng, tế bào được thu bằng ly tâm 4000 rpm, trong 10 phút.
1.5.2 Các phương pháp sinh học phân tử
Nhân bản gene (PCR)
Nguyên lý: PCR là phương pháp dùng enzyme khuếch đại chọn lọc một đoạn
DNA theo luật số mũ. Phản ứng nhân gene được thực hiện với DNA polymerase chịu nhiệt, hai mồi tổng hợp và 4 loại deoxyribonucleotide (dATP, dGTP, dCTP và dTTP).
Mỗi chu kỳ phản ứng nhân gene gồm 3 bước: bước 1 là biến tính DNA bằng cách tăng nhiệt độ phản ứng lên 95°C có tác dụng tách hai sợi đơn từ sợi khuôn xoắn kép, bước 2 là bắt cặp hai mồi vào hai sợi đơn của khuôn, bước 3 là kéo dài chuỗi theo mồi, chiều 5′-3′ với quá trình trùng hợp gắn các dNTP dọc theo sợi khuôn để tạo thành phiên bản mới theo nguyên tắc bổ sung.
Tính đặc hiệu của phản ứng được quy định bởi mồi và sự sao chép trực tiếp theo trình tự sợi khn giữa hai mồi. Như vậy, kết quả tạo ra hàng tỷ phiên bản sợi khuôn trong vài giờ.
Tiến hành: Gene msk được nhân bản với cặp mồi mSKF: GGC GGA TCC CAT
ATG ATT GCT GGA CCT G và mSKR: GC CTC GAG TCA TTT GTC TTT AGG GTT ATC trong phản ứng PCR có thành phần như trong bảng 2.4 và chu trình nhiệt 95C/4′, 35x (95C /45″; 55C /45″; 72C /45″), 72C /10′. Bảng 2.4. Thành phần PCR. Thành phần Nồng độ Thể tích (µl) Đệm 10x 2,50 MgCl2 2,50 dNTP 2 mM 2,00
Mồi xi 10 pmol/µl 1,00
Mồi ngược 10 pmol/µl 1,00
Taq-polymerase 5 U/µl 0,25
DNA khuôn* 50-100 ng/l 1,00
H2O khử ion vô trùng 14,75
Tổng thể tích 25,00
*DNA của S. Pyogenes đã được Vũ Hồng Diệp tách chiết trong nghiên cứu trước
Phản ứng nối ghép gene
Phản ứng gắn dính bao gồm 1 µl đệm gắn dính 10x; 0,5 µl DNA plasmid; 2 µl phân đoạn chèn DNA, 0,5 µl T4 ligase, 6 µl H2O cất vơ trùng; tổng thể tích 10 µl phản ứng. Trộn đều hỗn hợp phản ứng và ủ qua đêm ở 16°C.
Biến nạp hóa học
Plasmid được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5 và JM109(DE3) theo phương pháp sốc nhiệt và hóa học. Nguyên lý của phương pháp là E. coli được xử
lý bằng CaCl2 giúp DNA dễ dàng bám dính vào màng tế bào, khi sốc nhiệt, các lỗ màng tế bào mở rộng làm các phân đoạn DNA đi vào dễ dàng.
Chuẩn bị tế bào khả biến: Khuẩn lạc E. coli được nuôi trong 3 ml LB lỏng, lắc
LB mới và lắc ở điều kiện trên trong 2-3 giờ đạt OD600nm 0,4-0,7. Dịch nuôi cấy để lạnh 30 phút cho ổn định rồi ly tâm thu tế bào 5000 rpm trong 5 phút. Tế bào được ủ lần 1 với 0,1 M CaCl2 trong 45 phút, ly tâm thu tế bào. Ủ lần 2 với 0,1 M CaCl2 trong 20 phút. Tế bào đã qua xử lý được hòa trong 500 l 0,1 M CaCl2 và chia nhỏ thành các ống để biến nạp hoặc bảo quản ở tủ -84°C. Các thao tác được thực hiện ở 4°C.
Biến nạp plasmid vào E. coli: tế bào khả biến tươi hoặc từ -84oC được giải đông trong đá khoảng 30 phút. Cho 40 µl tế bào khả biến và 3 µl dung dịch sau phản ứng nối ghép gene vào một ống eppendorf mới, đảo nhẹ nhàng ủ trong đá khoảng 30 phút. Mẫu được sốc nhiệt ở 42°C trong 45 giây, sau đó đặt ngay vào trong đá 5 phút. Bổ sung 250 µl mơi trường LB lỏng và ni lắc 200 rpm ở 37°C trong 1 giờ. Cấy trải 100 µl dịch ni trên đĩa LB bổ sung 100 µg/ml ampicillin, ủ ở 37°C qua đêm.
Tách plasmid
Nguyên lý: Vi khuẩn được nuôi và nhân lên đến giai đoạn cuối của pha log. Tế
bào được phá vỡ bằng kiềm và các chất tẩy mạnh. DNA plasmid được thu lại bằng cách kết tủa với isopropanol.
Quy trình: Ni một dịng vi khuẩn trong 3 ml mơi trường LB lỏng có bổ sung
ampicillin (100 µg/ml) ở 37°C qua đêm. Lấy 1,5 ml dịch nuôi ly tâm 12000 rpm trong 1 phút, thu cặn tế bào. Bổ sung 150 µl sol I, trộn đều bằng máy lắc rung. Bổ sung tiếp 150 µl sol II, lắc đảo vài lần và để yên trong 2 phút. Bổ sung 150 µl sol III, lắc đều và giữ trong đá 5 phút để tủa protein. Thêm 450 µl chloroform:isoamyl alcohol (24:1), trộn đều và ly tâm 12000 rpm trong 10 phút ở 4°C. Chuyển dịch nổi sang ống eppendorf mới và bổ sung 320 µl isopropanol, trộn đều, ủ ở -20C trong 0,5-1 giờ. Ly tâm 12000 rpm trong 15 phút ở 4°C, thu tủa DNA plasmid. Rửa tủa bằng cồn 70% và ly tâm 12000 rpm trong 10 phút. Tủa DNA plasmid sau đó được làm khơ và hịa tan trong 50 µl TE. Điện di kiểm tra trên gel 0,8 % agarose.
Cắt plasmid bằng enzyme giới hạn
Plasmid được cắt với NdeI và XhoI trong 2-3 giờ ở 37°C. Tổng thể tích phản
ứng 10 µl gồm 5 đơn vị enzyme, 1 µl đệm 10x, 3 µl plasmid, bổ sung nước cho đủ thể tích. Sản phẩm cắt được kiểm tra trên gel 0,8% agarose.
Tinh sạch phân đoạn DNA
Phân đoạn DNA được tinh sạch bằng kit tinh sạch của hãng Promega. Mẫu DNA được chạy điện di trên gel 0,8% agarose để thu phân đoạn cần tinh sạch. Bổ sung 3 lần thể tích dung dịch liên kết (thể tích được qui đổi 1 g cho 1 ml). Ủ 55°C trong 15 phút cho gel tan hoàn toàn. Đưa dịch DNA lên cột, để 2 phút ở nhiệt độ phòng, ly tâm 13000 rpm trong 1 phút để loại dịch lỏng. Cột gắn DNA được rửa 2 lần với 500 μl dung dịch rửa và ly tâm 13000 rpm trong 1 phút. Thôi DNA bằng nước cất của hãng.
Điện di DNA
Nguyên lý: Vì nucleic acid là các đại phân tử sinh học tích điện âm nên khi chịu
tác động của điện trường không đổi chúng sẽ di chuyển từ cực âm về cực dương. Tốc độ chuyển động của chúng trong gel phụ thuộc vào kích thước. Các phân tử DNA có kích thước lớn hơn thì chạy chậm hơn các phân tử có kích thước nhỏ.
Quy trình: Chuẩn bị gel 0,8% agarose trong đệm 1x TBE được đun chảy hoàn toàn, để nguội khoảng 50°C rồi đổ vào khay điện di có cài sẵn lược. Để gel đơng khoảng 30 phút sau đó lấy lược ra cho bản gel vào bể điện di chứa đệm 1x TBE sao cho TBE ngập bản gel. 5 µl mẫu được trộn với 1 µl đệm tra mẫu 6x và đưa vào giếng. Gel được chạy điện di ở 100 V, 400 mA trong khoảng 30 phút. Quan sát sự di chuyển của màu bromophenol blue để biết khi nào ngừng điện di. Nhuộm bản gel trong EtBr khoảng 10 phút. Kết quả được phân tích trên máy soi gel.
Giải trình tự
Sau khi tinh sạch plasmid tái tổ hợp, phân đoạn chèn được giải trình tự theo nguyên lý của Sanger (1977) [47] dựa trên các dideoxynucleotide. DNA polymerase xúc tác gắn các deoxynucleotide vào mạch đơn DNA đang tổng hợp vào đầu 3'-OH, khi gặp dideoxynucleotide đánh dấu huỳnh quang khơng có nhóm 3'-OH phản ứng
tổng hợp sẽ dừng lại. Nồng độ của mỗi dideoxynucleotide được xác định thận trọng để đảm bảo sự gắn hỗn hợp các chuỗi đang tổng hợp tại mỗi vị trí có thể và khơng gắn ở vị trí đầu tiên của nucleotide bổ trợ của khuôn. Kết quả là hỗn hợp sản phẩm sau phản ứng bao gồm các polynucleotide có kích thước hơn kém nhau một nucleotide [32].
Plasmid nhân dòng pJmSK, plasmid biểu hiện pEmSK được tinh sạch theo phương pháp chuẩn dùng làm khn chạy PCR để đọc trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer. Phần mềm DNAStar và BLAST được sử dụng phân tích, so sánh trình tự nucleotide và amino acid.
1.5.3 Các phương pháp hóa sinh
Điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide
Nguyên lý: Gel polyacrylamide (SDS-PAGE) được sử dụng để điện di protein
với nồng độ 15% theo phương pháp điện di biến tính của Laemmli (1970). Nguyên lý của phương pháp là các phân tử protein trong mơi trường có SDS sẽ bị duỗi thẳng và trở nên tích điện âm, do vậy sẽ di chuyển về cực dương trong điện trường với tốc độ phụ thuộc vào khối lượng phân tử của chúng.
Bảng 2.5. Thành phần gel co và gel tách. Thành phần Gel tách (µl) Gel co (µl) Thành phần Gel tách (µl) Gel co (µl) H2O 1940 1180 Dung dịch A 1500 0 Dung dịch B 0 500 Dung dịch C 2500 300 SDS 10% 60 20 Ammonium persulfate 10% 24 10 TEMED 7 5 Tổng 6031 2015
Quy trình: Bản gel được đổ hai lớp, lớp dưới là gel tách được đổ cách mặt trên