1.1 .Tiềm năng nguồn gen lúa địa phương Việt Nam
1.6. Nghiên cứu chọn lọc lúa chịu mặn, hạn dựa vào chỉ thị phân tử ADN
1.6.1. Chọn lọc dựa vào chỉ thị phân tử (Marker assisted selection – MAS)
Các nghiên cứu trước đây về chọn lọc dựa vào tính trạng kiểu hình đã đạt được những thành tựu nhất định và có thể hữu ích, nhưng khả năng ứng dụng rộng rãi của phương pháp này lại bị giới hạn vì gặp khó khăn trong đánh giá cá thể với số lượng lớn khi cách ly các thế hệ. Khi kĩ thuật ADN ra đời, các nhà khoa học đã phát triển phương pháp chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử giúp lựa chọn các cá thể trong quần thể phân ly từ giai đoạn đầu của q trình sinh trưởng thơng qua các chỉ thị liên kết chặt với tính trạng mong muốn xác định. Phương pháp MAS giúp chọn lọc được các kiểu gen một cách chính xác và hiệu quả hơn, nhằm phát triển giống nhanh hơn; trong quá trình nghiên cứu, chỉ cần sử dụng một lượng nhỏ ADN được tách chiết từ mỗi cây ở các thế hệ để kiểm tra mà không cần phá hủy tồn bộ cây. Vì vậy, phương pháp tiếp cận này có thể thực hiện nhiều lần trong năm mà không cần sự biểu hiện của cây với stress nhân tạo, không tồn nhiều thời gian và chi phí nghiên cứu. Thêm vào đó, MAS là phương pháp hữu ích để kết hợp tất cả các gen quan trọng, bao gồm cả các gen có khả năng chống chịu mặn, hạn, .v.v. Khả năng chỉ thị gen liên kết chặt với các gen chống chịu giúp xác định thực vật mang gen mà không cần bắt chúng phải chịu các stress phi sinh học trong các thế hệ ban đầu. Tuy nhiên, một vấn đề cần được lưu ý khi tiến hành thực hiện phương pháp này đó là nếu sử dụng các chỉ thị chọn lọc có khoảng cách liên kết xa so với gen mong muốn sẽ dẫn đến tái tổ hợp giữa chỉ thị và gen, gây ra sự nhầm lẫn tích cực hoặc tiêu cực trong quá trình chọn lọc.
Hướng chọn tạo giống bằng chỉ thị phân tử (MAS) là sự kết hợp giữa phương pháp truyền thống và công nghệ sinh học. Tuy nhiên, trước khi thực hiện hướng chọn tạo giống tiềm năng này, các gen quy định những đặc tính quan tâm như năng suất, khả năng chống chịu mặn (hạn, ngập…), chống chịu bệnh, phẩm chất.v.v. cần được lập bản đồ phân tử [4]. Những thông tin về bản đồ gen, chỉ thị liên kết với gen đóng vai trị rất quan trọng và sẽ được sử dụng trong quá trình chọn tạo giống. Nói một cách cụ thể, q trình nhận dạng QTLs (Quantitative trait loci)
tác động đến khả năng chống chịu stress là mục đích chính để cải thiện khả năng chống chịu stress ở thực vật bằng MAS. QTLs (Quantitative trait loci) là các vùng di truyền có ảnh hưởng nhiều đến biểu hiện của tính trạng số lượng (là tính trạng được kiểm soát bởi nhiều hơn một gen và được gọi là tính trạng đa gen) hơn so với các vùng khác. Trong đó, tính trạng số lượng đang được các nhà khoa học quan tâm trong những năm gần đây là các tính trạng chống chịu stress như mặn, hạn, ngập úng, bệnh hại,.v.v. hay tính trạng chiều cao cây, năng suất, thời gian ra hoa,.v.v.
1.6.2. Nghiên cứu chọn lọc dựa vào chỉ thị (MAS) đối với quá trình cải thiện khả năng chống chịu mặn, hạn ở lúa khả năng chống chịu mặn, hạn ở lúa
Như đã đề cập ở trên, nếu QTLs tác động đến các tính trạng thứ cấp của khả năng chống chịu mặn, hạn ở lúa được vẽ bản đồ và mô tả chính xác thì mục đích cải thiện khả năng chọn lọc nhờ chỉ thị MAS sẽ gặp nhiều thuận lợi. Trong thập kỉ trước, khơng có nhiều giống lúa chống chịu mặn hoặc hạn được phát triển và phổ biến đến nông dân bằng MAS mặc dù đã có một vài thí nghiệm được tiến hành. Tuy nhiên, thành tựu nghiên cứu của các nhà khoa học thì khơng thể phủ nhận. Nghiên cứu khả năng chống chịu mặn, hạn ở các loại cây trồng nói chung và cây lúa nói riêng vẫn khơng ngừng được phát triển, kết quả của các nghiên cứu đã mang lại nhiều thơng tin hữu ích, giúp cơng tác chọn tạo giống được thuận lợi, từ đó có thể tạo ra các sản phẩm nơng nghiệp phù hợp điều kiện khí hậu đang bị biến đổi với sản lượng cao, chất lượng tốt, mang lại giá trị kinh tế cho người nông dân.
1.6.2.1. Thành tựu trong nghiên cứu về khả năng chống chịu mặn ở lúa
Đối với khả năng chống chịu mặn, các nghiên cứu về khả năng thích nghi, cơ chế chống chịu của cây lúa đã được tiến hành từ thế kỉ trước. Tuy nhiên, với hiện trạng biến đối khí hậu ngày nay, thì các nghiên cứu tập trung vào cải tạo giống lúa chống chịu mặn cho năng suất cao đang được chú trọng, đặc biệt là các nghiên cứu chọn tạo dựa vào chỉ thị phân tử.
Vào năm 2002, Shen và cs. đã báo cáo những nỗ lực nghiên cứu ở IRRI để chuyển một đoạn gen lớn trên nhiễm sắc thể số 1 có chứa QTL liên quan đến sự đâm sâu và mọc rậm của rễ vào giống lúa nương IR64 từ giống Azucena, nhờ sử
dụng MAS. Tương tự, nghiên cứu của Bonilla và cs., 2002 đã vẽ được bản đồ liên kết chặt của QTL Saltol 1 có ảnh hưởng đến khả năng chống chịu mặn ở giai đoạn mạ của lúa và bản đồ này được ứng dụng trong phương pháp MAS để cải thiện khả năng chống chịu mặn của các giống lúa quan tâm. Đến năm 2006, Steele K.A. và cs. đã có thể sử dụng 4 QTLs liên quan đến khả năng đâm sâu của rễ từ giống ưu việt Azucena, Kalinga III bằng MAS, nhưng chỉ 1 trong 4 QTL đích đã thể hiện hiệu quả sự tăng chiều dài rễ mong muốn. [13, 63]
Trong nhiều năm gần đây, các nhà khoa học tập trung nghiên cứu lập bản đồ di truyền, nhận dạng QTLs liên quan đến chống chịu mặn và chỉ thị liên kết, đã xác định được các locut chịu trách nhiệm đối với sự khác nhau của các tính trạng số lượng như khả năng chống chịu mặn. Theo nghiên cứu Singh R.K. và cs.,2007; Haq T.U. và cs.,2010, các nghiên cứu lập bản đồ xác định QTL liên quan đến khả năng chống chịu mặn ở lúa đã được tổng hợp, trong đó có một số nghiên cứu như: nghiên cứu của Lin và cs., 2004 về xác định QTLs liên quan đến hàm lượng K+trong chồi trên nhiễm sắc thể 1 (qSKC-1) và hàm lượng Na+
trong chồi trên nhiễm sắc thể 7 (qSNC-7) [26, 62]. Nghiên cứu của Ren và cs., 2005 tìm thấy gen SKC1 mã hóa cho sự vận chuyển muối giúp điều hòa nội cân bằng ion K+ dưới điều kiện stress mặn [58]. Tương tự như vậy, nghiên cứu của Bonilla và cs., 2002 đã bổ sung chỉ thị RFLP và SSR trên vùng Saltol và nghiên cứu sàng lọc thủy canh giai đoạn mạ ở 54 dòng RILs (Recombinant inbred line), kết quả cho thấy QTLs này giải thích 43% sự khác biệt tỉ lệ Na-K trong chồi ở giai đoạn mạ .
Đến năm 2009, bằng sử dụng chỉ thị SSR trên quần thể lúa F2 có nguồn gốc từ phép lai giữa giống chịu mặn cv.Tarommahali và giống mẫm cảm mặn cv.Khazar, nhóm nghiên cứu của Sabouri H. và Biabani A. đã công bố 4 QTLs liên quan đến hàm lượng Na+ trên nhiễm sắc thể 2, 3 và 6; 3 QTLs liên quan đến hàm lượng K+
trong chồi trên nhiễm sắc thể 5 và 6; 2 QTLs liên quan đến tỉ lệ Na+/K+ trên nhiễm sắc thể 3 và 6. Cũng trong năm này, kết quả nghiên cứu của Kim và cs. đã gợi ý rằng giống FL478 (là dòng RIL được chọn tạo có khả năng chống chịu mặn, chiều cao thấp hơn và ra hoa sớm hơn so với giống gốc Pokkali) có chứa một
đoạn ADN 1Mb từ Pokkali tại 10.6 – 22.5 Mb trên nhiễm sắc thể, được liên kết bên bởi alen IR29 [59].
Năm 2010, trên tạp trí Rice, nhóm tác giả Michael J.T. và cs. đã mơ tả đặc điểm QTLs có nguồn gốc từ Pokkali đối với khả năng chống chịu mặn ở giai đoạn mạ. Nghiên cứu đã dựa vào phân tích của 100 chỉ thị SSR trên 140 dịng nội phối tái tổ hợp (RILs) để xác định vị trí của QTLs Saltol trên nhiễm sắc thể 1 và nhận dạng QTLs bổ sung liên quan đến chống chịu. Phân tích một loạt các dịng hồi quy và các dịng cận di truyền (NILs) được phát triển để mơ tả chi tiết hơn ảnh hưởng của locut
Saltol liên quan, kết quả cho thấy Saltol chủ yếu giúp điều hòa nội cân bằng tỉ lệ
Na+/ K+ ở chồi [47]. Vì vậy, mặc dù locut Saltol biểu hiện phức tạp, nhưng nó đã
cung cấp một cơ hội cho chọn tạo giống hồi quy nhờ chỉ thị phân tử để cải thiện khả năng chống chịu mặn các giống phổ biến. Trong khi đó, nghiên cứu của Alam và cs., 2011 nghiên cứu QTLs chống chịu mặn giai đoạn mạ trên các dịng lai hồi quy có nguồn gốc từ lúa Pokkali thông qua sàng lọc và đánh giá di truyền với chỉ thị SSR tại đa locut ở 12 nhiễm sắc thể [8]. Ngoài ra, nghiên cứu của Aliyu và cs., 2011 đã nghiên cứu chỉ thị SSR liên quan đến QTLs Saltol, trong đó 2 QTLs liên quan đường kính lá đã xuất hiện trong vùng Saltol với chỉ thị SSR RM493 và RM3412 [9]. Hai chỉ thị này có thể phân biệt kiểu gen chống chịu dựa vào đường kính lá. Các chỉ thị này có thể có ích trong lập bản đồ phân tử và chọn lọc nhờ phân tử. Nghiên cứu của Islam và cs., 2011 đã lập bản đồ chống chịu mặn tại giai đoạn mạ ở lúa sử dụng 260 chỉ thị SSR và 2 chỉ thị EST, kết quả chỉ ra vị trí QTLs trên nhiễm sắc thể 1 được đánh dấu bởi chỉ thị biên RM8094 và RM3412 tương đương với vùng QTL Saltol đã được nghiên cứu trước đây, 2 QTLs khác ảnh hưởng tương đối lớn được đánh dấu bởi chỉ thị biên RM25 và RM210 trên nhiễm sắc thể 8 và RM25092 và RM25519 trên nhiễm sắc thể 10 [28]. Các QTLs trên đều có ích đối với chọn giống nhờ chỉ thị phân tử để cải thiện khả năng chống chịu mặn. Nghiên cứu của Moniruzzaman và cs., 2013 đã sử dụng chỉ thị SSR để xác định khả năng chống chịu mặn của các dịng lúa, trong đó có 3 chỉ thị RM 336, RM 510, và
RM585 có thể sử dụng để xác định gen đích chống chịu, trong chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lập bản đồ QTL [50].
Ở Việt Nam, từ khi phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử MAS được ủng hộ mạnh mẽ từ năm 1995, các nhà khoa học cũng đã cố gắng cải tiến nhiều giống lúa có tính chống chịu mặn nhằm khắc phục sản lượng lúa đang bị ảnh hưởng bởi sự biến đổi khí hậu tồn cầu, đặc biệt là hiện tượng nước biển dân cao và xâm nhiễm mặn ở các vùng đồng bằng trồng lúa. Đi đầu trong nghiên cứu lúa chịu mặn, là nhóm tác giả Nguyễn Thị Lang và Bùi chí Bửu, 2001 có một loạt các nghiên cứu tập trung về xác định QTL liên quan đến khả năng chống chịu mặn, các chỉ thị SSR liên kết với khả năng chống chịu mặn của lúa ở đồng bằng Sông Cửu Long [42-44]. Kết quả nổi bật từ các nghiên cứu trên đó là lập được bản đồ QTL những tính trạng mục tiêu liên quan đến khả năng chống chịu mặn (số ngày sống sót, trọng lượng khơ của rễ, trọng lượng khô của chồi, hàm lượng Na+, K+, tỉ lệ Na+/K+ ) trên các tổ hợp lai khác nhau, xác định được chỉ thị RM223 trên nhiễm sắc thể số 8 liên kết rõ ràng với gen chống chịu mặn ở giai đoạn mạ, chỉ thị OSR1 và RM315 liên kết với QTL liên quan đến chống chịu mặn ở lúa được định vị trên nhiễm sắc thể 1. Đến năm 2008, Nguyễn Thị Lang và cs. đã nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa mặn bằng kĩ thuật nuôi cấy túi phấn đã tạo ra 72 dòng lúa, kết quả thanh lọc mặn thông qua dữ liệu chỉ thị RM223 với 72 dòng này đã thể hiện sự phân tách giữa các giống chống chịu và mẫm cảm [39]. Từ năm 2009 đến nay, tại viện lúa Đồng bằng sông Cửu Long, đã bước đầu tìm được hơn 30 dòng lúa triển vọng chống chịu mặn, một số có khả năng chống chịu mặn cao như OM6976, OM6677, OM5464, OM5629, OM5166, OM5451, OM4059, OM6164, .v.v. Trong đó giống OM5464, OM6976 và OM5166 đã được Bộ Nông nghiệp công nhận là giống lúa sản xuất thử.
Trong khi đó, với điều kiện khí hậu của vùng đồng bằng sông Hồng, các nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn cũng đang được thúc đẩy nghiên cứu. Năm 2012, nghiên cứu của nhóm tác giả Vũ Thị Thu Hiền và cs. đã áp dụng MABC (marker –assisted backcroosing) để chuyển QTLs Saltol ở giống lúa chống chịu
mặn FL478 vào giống lúa truyền thống Bắc thơm 7, kết quả đã chỉ ra các thế hệ con BC3F3 mang đoạn gen cho (11.16 – 12.6 Mb), trong đó mang 96.8 % đến 100% gen giống nhận [27]. Cũng trong năm này, nghiên cứu của Lã Tuấn Nghĩa và Lê Thị Thu Trang, 2012 về sự thay đổi hàm lượng chlorophyll, carotenoid đã chỉ ra hàm lượng chlorophyll a, chlorophyll b và carotenoid ở các giống lúa chịu mặn giảm ít hơn so với lúa mẫn cảm, đồng thời kết quả xác định alen chống chịu bằng chỉ thị RM223 của 54 giống lúa trong điều kiện mặn đã cho thấy 37 giống chống chịu mặn từ trung bình trở lên có xuất hiện alen chống chịu, và 17 giống cịn lại khơng xuất hiện alen chống chịu mặn [3].
1.6.2.2. Thành tựu trong nghiên cứu về khả năng chống chịu hạn ở lúa
Hạn hán là yếu tố stress phi sinh học nghiêm trọng nhất làm giới hạn năng suất lúa. Cây lúa (Oryza sativa L.) thường phát triển dưới điều kiện ngập nước, dễ bị tổn thương khi gặp stress hạn vì rễ của chúng phân bố nơng, khả năng hút nước ở các tầng đất sâu bị giới hạn. Hiện nay, sự ấm lên toàn cầu đang là nguyên nhân gây hạn hán nghiêm trọng đến các vùng trồng lúa, vì thế việc tăng khả năng chống chịu hạn là chiến lược quan trọng để ổn định sản xuất lúa gạo ở các nước nông nghiệp. Với thực tế này, các nhà khoa học đã ứng dụng phát triển cơng nghệ sinh học để tìm cơ hội cải tiến tính trạng chống chịu hạn ở lúa. Hầu hết các nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử đều tập trung đến tính trạng thứ cấp liên quan đến khả năng chống chịu hạn như khả năng đâm sâu của rễ, sự điều tiết áp suất thẩm thấu, độ cuốn lá, hiệu quả sử dụng nước, .v.v. Nhiều phân tích QTL đối với tính trạng hình thái rễ như chiều dài tối đa, độ dày, thể tích và phân bố đã biểu hiện sự khác biệt ở quần thể lập bản đồ. Tương tự, Steele và cs., 2006 đã báo cáo một QTL liên quan đến chiều dài rễ nằm giữa RM242 và RM201 trên nhiễm sắc thể số 9 [63]. Ngày nay, 675 QTLs liên quan đến các tính trạng rễ đã được phát hiện (tổng kết bởi Courtois và cs., 2009). Gần đây nhất là nghiên cứu của Obara và cs., 2010 đã vẽ bản đồ
qRL6.1, là QTL liên quan đến chiều dài rễ, trên nhiễm sắc thể số 6 đối với sự sinh
Uga Y. và cs., đã lập bản đồ QTL Dro1 liên quan đến góc nghiên đâm sâu của rễ lúa ở điều kiện ruộng nương giữa chỉ thị RM24393 và RM7424 [66].
Bên cạnh QTL liên quan đến các tính trạng hình thái rễ, cũng đã có nhiều nghiên cứu về các tính trạng thứ cấp khác liên quan đến khả năng chống chịu hạn của lúa, đã lập bản đồ QTL về khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu (OA) và các tính trạng liên quan đến rễ, kết quả phát hiện được 6 vùng genome liên quan đến khả năng chịu hạn trên nhiễm sắc thể 2, 3, 4, 7, 8 và 9. Ngoài ra, nghiên cứu của Gomez và cs., 2006 tiến hành lập bản đồ QTL liên kết với các tính trạng hình thái và các tính trạng cấu thành năng suất ở lúa dưới điều kiện khô hạn, kết quả xác định được 24 QTL và các chỉ thị phân tử liên kết với các QTL này [23]. Năm 2010,