1.1 .Tiềm năng nguồn gen lúa địa phương Việt Nam
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu lá lúa
Nghiên cứu sử dụng phương pháp tách chiết ADN tổng số theo Zheng và cs., 1995 có cải tiến [72].
Cắt khoảng 1-2 g lá mạ (2 tuần tuổi) cho vào cối chày sứ nghiền với nitơ lỏng thành dạng bột mịn sau đó cho vào ống eppendorf 2ml; bổ sung 800µl CTAB 2% (có bổ sung 0.5% Nabisulfite), trộn đều bằng vortex, ủ 65 0C trong 10 phút; tiếp tục cho 800µl Cloroform: isoamyl alcohol (24:1), lắc đều 20 phút ở nhiệt độ phòng. Sau 20 phút, tiến hành ly tâm mẫu với 12000v/p trong 10 phút, hút dịch nổi bên trên cho vào ống eppendorf 1.5 ml mới; Tiến hành bổ sung 470µl Isopropanol, lắc nhẹ, để lạnh -20 0
C khoảng 1-2 h; sau đó ly tâm 12000v/p trong 10 phút, thu tủa và rửa bằng 800µl cồn 70%, để khơ tủa hồn tồn rồi bổ sung 100µl TE vào (ở 4oC, qua đêm).
Sau khi ADN tan hồn tồn trong dung dịch TE, bổ sung 2 µl Rnase (10mg/ ml) ủ ở 37 0C trong 30 phút; sau đó cho 1/10 thể tích Sodium acetat 3M (20µl). Tiếp tục cho 400µl cồn tuyệt đối, để tủ lạnh -20oC (60 phút); Tiến hành ly tâm 12000v/p trong 5phút, sau đó loại bỏ pha nước thu tủa, rửa tủa bằng EtOH 70% và để khơ; Sau khi ADN khơ, cho 100µl TE vào, để tan hoàn toàn và bảo quản -4 0C.
Sau khi tách chiết, các mẫu ADN tổng số được kiểm tra nồng độ, độ tinh sạch và nguyên vẹn cùng với Lamda 50ng trên gel agarose 1% trong môi trường đệm TBE 0,5X trên hệ thống điện di ngang Bio-rad. Sau đó, bản gel được nhuộn
trong dung dịch Ethidium Bromide 0.5ng/ml. Độ tinh sạch, nguyên vẹn và nồng độ ADN của các mẫu được xác định thơng qua hình ảnh điện di giữa các băng ADN giống và lamda chuẩn.
2.2.2. Xác định alen chống chịu mặn, hạn
ADN tổng số của 200 giống lúa nghiên cứu và 4 giống đối chứng được tiến hành phản ứng PCR với các chỉ thị SSR (Bảng 2.2; Bảng 2.3) theo thành phần phản ứng và chu trình như sau:
STT Thành phần Thể tích (1 phản ứng) (µl)
1 H2O 12.4
2 PCR Buffer 10X 2.0
3 dNTP (2,5 mM) 1.6
4 Primer (F & R) (25ng/µl) 1.4
5 Green Taq (5U/l) 0.1
6 ADN (5ng/µl) 2.5 Tổng 20 Chu trình PCR: 95°C -------- 5 phút 94°C ------- 1 phút Ta ------- 1 phút 35 chu kỳ 72°C ------- 1 phút 72°C ------- 7 phút 4°C -------- ∞
Ghi chú: Ta là nhiệt độ gắn mồi (khác nhau tùy vào từng cặp mồi SSR)
Sản phẩm PCR được điện di trên gel polyacrylamide 8% với ladder 50bp, nhuộm bằng ethidium 0,5 µg/ml 15 phút. Sau đó gel được soi và chụp bằng hệ thống chụp ảnh và phân tích hình ảnh MultiDoc It – UVP.
Sau khi được ghi nhận hình ảnh điện di, kết quả băng điện di sản phẩm SSR- PCR của 200 giống nghiên cứu sẽ được so sánh với băng điện di của giống đối chứng. Giống nghiên cứu được xác định là có alen chống chịu (mặn, hạn) khi xuất hiện băng ADN có kích thước bằng với băng ADN của giống đối chứng chuẩn
2.2.3. Đánh giá khả năng chống chịu mặn trong điều kiện phịng thí nghiệm
Thí nghiệm đánh giá khả năng chống chịu mặn trong phịng thí nghiệm được thực hiện theo tiêu chuẩn đánh giá SES của IRRI, 1996. Các bước thực hiện như sau: ngâm và ủ thóc ở 37oC đến khi nảy mầm, sau đó xếp các hạt thóc nảy mầm vào các rãnh trên tấm xốp (khoảng 10 hạt) và bổ sung dung dịch dinh dưỡng Yoshida vào các khay nhựa để hạt lúa phát triển bình thường. Sau 3 ngày chăm sóc, tiến hành thanh lọc mặn bằng dung dịch yoshida có bổ sung muối ở 2 nồng độ EC = 6ds/m (NaCl 0,3%) và EC = 12ds/m (NaCl 0,6%), điều chỉnh pH bằng NaOH / HCl để đạt được độ pH=5. Dung dịch dinh dưỡng được thay 2 ngày/ lần. Kiểm tra độ pH hằng ngày để ln duy trì pH = 5.
Thí nghiệm tiến hành đánh giá các chỉ tiêu sinh trưởng ở mốc thời gian 7 ngày, 14 ngày, và 21 ngày sau khi xử lý gồm:
- Chiều dài rễ (cm): tính từ cổ rễ đến đỉnh sinh trưởng của chóp rễ dài nhất - Chiều dài thân (cm): tính từ cổ rễ đến đỉnh sinh trưởng của chồi ngọn cây cao nhất - Số liệu đánh giá chiều dài rễ và chiều dài thân được xử lý bằng phần mềm IRRISTAT 5.0
Sau khi giống IR 28 chết gần như hoàn toàn (khoảng 3 tuần), tiến hành đánh giá khả năng chống chịu mặn theo tiêu chuẩn (SES). (Bảng 2.4)
Bảng 2.4. Tiêu chuẩn đánh giá mặn (SES) ở giai đoạn tăng trưởng và phát triển (IRRI,1996)
Điểm Quan sát Mức chống chịu
1 Tăng trưởng bình thường, khơng có vết cháy lá Chống chịu tốt
3 Gần như bình thường, nhưng đầu lá hoặc vài lá có vết
trắng, lá hơi cuốn lại Chống chịu
5 Tăng trưởng chậm lại, hầu hết lá bị khô, một vài chồi bị chết
Chống chịu Trung bình
7 Tăng trưởng bị ngưng lại hồn tồn, hầu hết lá bị khơ,
một vài chồi bị chết Nhiễm
2.2.4. Đánh giá khả năng chống chịu hạn trong điều kiện phịng thí nghiệm
Phương pháp của Vũ Văn Viết và cs., 2004, được áp dụng để đánh giá khả năng chống chịu hạn trong điều kiện phịng thí nghiệm. Mỗi giống chuẩn bị 300 hạt cho 3 lần nhắc lại, sau đó hạt được xử lý với KClO3 3% và Saccarin 1%.
Xử lý bằng dung dịch KClO3 3% là phương pháp nhân tạo, đánh giá gián
tiếp khả năng chịu hạn của các giống. Khả năng chịu hạn của cây liên quan đến khả năng chịu độc và giữ nước của keo nguyên sinh khi dùng hóa chất độc để xử lý. Nếu keo nguyên sinh ít bị độc, tế bào và mơ ít bị mất nước, ít bị hại, chứng tỏ cây có tính chịu hạn. Ngược lại, nếu keo ngun sinh bị nhiễm độc, tế bào và mô bị mất nước dẫn đến cây bị hại, chứng tỏ cây khơng có tính chịu hạn. Các bước thực hiện thí nghiệm được tiến hành gồm: ngâm hạt trong dung dịch KClO3 3% trong 48 giờ. Sau đó, rửa sạch bằng nước trung tính rồi chuyển sang đĩa petri có lót giấy lọc ẩm. Tiếp tục ủ hạt ở nhiệt độ 37oC để hạt nảy mầm.Dựa vào tỷ lệ hạt nảy mầm để đánh giá khả năng chịu hạn.
Xử lý bằng dung dịch Saccarin 1%: được tiến hành tương tự như phương
pháp xử lý bằng KClO3 với thời gian ngâm hạt 7 ngày.
Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của các giống sẽ được tổng hợp theo bảng 2.5 sau khi xử lý hạt với dung dịch KClO3 3% và Saccarin 1% .
Bảng 2.5. Thang điểm đánh giá mức chống chịu hạn của lúa sau khi xử lý KClO3 3% và Saccarin 1%
Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây con: Đánh giá khả năng chịu
hạn thông qua sinh trưởng của mầm và bộ rễ trong dung dịch KClO3 1%. Sử dụng
Tỷ lệ hạt nảy mầm trong Saccarin 1% (%) Tỷ lệ hạt nảy mầm trong KClO3 3% (%) Điểm đánh giá Mức chống chịu > 70 > 90 0 Tốt > 50 > 70 1 Khá 20 -50 50-70 2 Trung bình < 20 < 50 3 Kém
ngẫu nhiên hoàn toàn, 3 lần lặp lại. Sau 7 ngày xử lý, tiến hành đo chiều dài thân, và rễ của các giống nghiên cứu, số liệu ghi nhận sẽ được xử lý bằng phần mềm IRRISTAT 5.0.
2.2.5. Đánh giá một số đặc tính cấu thành năng suất và thời gian sinh trưởng của lúa của lúa
Thí nghiệm thực hiện đánh giá một số đặc tính cấu thành năng suất và thời gian sinh trưởng dựa theo biểu mẫu đánh giá của Trung tâm Tài nguyên thực vật và theo hướng dẫn của IRRI.
- Địa điểm thí nghiệm: Trung tâm Tài Nguyên Thực Vật An Khánh – Hoài Đức – Hà Nội - Thời gian thực hiện: 6-2013 đến 12-2013
- Các chỉ tiêu đánh giá gồm:
1. Khả năng đẻ nhánh: đếm tổng số nhánh vào giai đoạn làm đòng. Lấy giá trị số nhánh trung bình của 5 cây ngẫu nhiên / giống.
2. Chiều cao cây: đo từ mặt đất đến mút bơng vào giai đoạn chín sữa đến chín hồn tồn. Lấy giá trị chiều cao trung bình của 5 cây ngẫu nhiên / giống. 3. Số bơng/ khóm: đánh giá vào giai đoạn chín sữa, chín hồn tồn.
4. Chiều dài bông: đánh giá vào giai đoạn chín sáp, đo thực tế từ cổ bông đến đỉnh bông. Lấy giá trị chiều dài trung bình của 5 cây ngẫu nhiên / giống. 5. Tổng số hạt/bông: Đánh giá vào giai đoạn chín sáp đến chín hồn tồn. Lấy
giá trị số hạt trung bình của 5 bơng ngẫu nhiên / giống.
6. Tỷ lệ hạt chắc: Đánh giá vào giai đoạn chín sáp đến chín hồn tồn. Lấy giá trị trung bình của 5 bơng ngẫu nhiên / giống.
7. Trọng lượng 1000 hạt: thực hiện 3 lần. Mỗi lần 200 hạt lấy trung bình nhân 5, vào giai đoạn chín hồn tồn. Kết quả lấy giá trị trung bình 3 lần cân. 8. Chiều dài hạt: Đo ở giai đoạn chín hồn tồn (n =5), lấy chiều dài trung bình
từ gốc vỏ mày lên tới mỏ hạt (đỉnh vỏ trấu) của 5 hạt ngẫu nhiên.
9. Chiều rộng hạt: Đo vào giai đoạn chín hồn tồn (n = 5), lấy giá trị trung bình chiều ngang chỗ rộng nhất giữa 2 nửa vỏ trấu của 5 hạt ngẫu nhiên.
10. Thời gian sinh trưởng: số ngày từ khi gieo đến lúc hạt chín (85% số hạt trên bơng đã chín).
11. Năng suất lý thuyết = (số hạt/bơng x số bơng/khóm x số khóm/m2 x tỉ lệ hạt chắc x trọng lượng 1000 hạt) / 10000.
Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định alen chống chịu mặn, hạn bằng chỉ thị phân tử 3.1.1. Tách chiết ADN tổng số các giống lúa nghiên cứu
Tách chiết ADN tổng số là cơng việc đầu tiên có vai trị quan trọng trong kĩ thuật phân tử. Hiện nay, có rất nhiều phương pháp tách chiết ADN tổng số thực vật, nhưng tùy vào từng mẫu thực vật nhất định sẽ có quy trình tách chiết tương ứng nhằm thu được nồng độ ADN cao mà vẫn đảm bảo độ tinh sạch và nguyên vẹn của mẫu.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp tách chiết ADN của Zheng và cs., 1995 được cải tiến để phù hợp với điều kiện nghiên cứu. Phương pháp sử dụng Cetyl-trumethyl-amonium-bromid (CTAB) để hòa tan các chất giải phóng ra từ màng tế bào sau khi màng này bị phá vỡ bởi nitơ lỏng, đồng thời tách ADN ra khỏi polysaccarit. Ngoài ra, khi bổ sung thêm Nabisulfite 0.5% vào dịch chiết, sẽ có tác dụng giảm sự oxy hóa của polyphenol ở nhiệt độ phịng, ngăn cản polyphenol chuyển hóa thành dạng quinon có khả năng liên kết với axit nucleic làm ảnh hưởng đến quá trình tách chiết.
Kết quả tách chiết ADN của 200 giống nghiên cứu và 4 giống đối chứng theo phương pháp trên rất tốt, ADN thu được ngun vẹn, khơng lẫn tạp và có nồng độ khá cao từ 50 đến 200 ng/µl, hồn tồn đáp ứng được các u cầu thí nghiệm tiếp theo. (Hình 3.1)
3.1.2. Xác định alen chống chịu mặn
ADN tổng số của 200 giống lúa nghiên cứu và 2 giống đối chứng (Pokkali và IR28) được pha loãng xuống nồng độ 5 ng/µl để tiến hành thực hiện phản ứng PCR với 5 chỉ thị SSR liên kết với QTL chống chịu mặn (Bảng 2.2) theo phương pháp 2.2.2.
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của một số giống lúa nghiên cứu bằng chỉ thị liên kết với QTLs/gen chống chịu mặn RM 8094
Ghi chú: Kháng mặn: giống Pokkali Nhiễm mặn: giống IR28
Băng ADN của các giống được ghi chú theo số đăng kí (phụ lục 1)
Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của một số giống lúa nghiên cứu bằng chỉ thị liên kết với QTLs/gen chống chịu mặn RM 3412
Ghi chú: Kháng mặn: giống Pokkali Nhiễm mặn: giống IR28
Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của một số giống lúa nghiên cứu bằng chỉ thị liên kết với QTLs/gen chống chịu mặn RM 223
Ghi chú: Kháng mặn: giống Pokkali Nhiễm mặn: giống IR28
Băng ADN của các giống được ghi chú theo số đăng kí (phụ lục 1)
Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của một số giống lúa nghiên cứu bằng chỉ thị liên kết với QTLs/gen chống chịu mặn RM 10745
Ghi chú: Kháng mặn: giống Pokkali Nhiễm mặn: giống IR28
Băng ADN của các giống được ghi chú theo số đăng kí (phụ lục 1)
Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của một số giống lúa nghiên cứu bằng chỉ thị liên kết với QTLs/gen chống chịu mặn RM 206
Hình 3.7. Kết quả so sánh kích thước alen của các giống lúa nghiên cứu với giống đối chứng tại 5 locut liên kết với QTLs chống chịu mặn
Hình 3.8. Kết quả so sánh kích thước alen của các giống lúa nghiên cứu với giống đối chứng tại 5 locut liên kết với QTLs chống chịu mặn (Tiếp)
Hình 3.9. Kết quả so sánh kích thước alen của các giống lúa nghiên cứu với giống đối chứng tại 5 locut liên kết với QTLs chống chịu mặn (Tiếp)
Hình 3.10. Kết quả so sánh kích thước alen của các giống lúa nghiên cứu với giống đối chứng tại 5 locut liên kết với QTLs chống chịu mặn (Tiếp)
Hình 3.11. Kết quả so sánh kích thước alen của các giống lúa nghiên cứu với giống đối chứng tại 5 locut liên kết với QTLs chống chịu mặn (Tiếp)
Dựa vào kết quả so sánh alen của các giống nghiên cứu với giống đối chứng (Hình 3.7; 3.8; 3.9; 3.10; 3.11), đề tài đã tổng hợp được các giống có xuất hiện băng alen có chiều dài bằng với đối chứng chuẩn kháng Pokkali nhiều nhất tại 4/5 locut là Nếp nõn tre (SĐK 6196), tiếp đó là các giống Dự nghểu Hịa Bình (SĐK 88), Nếp chuối Hịa Bình (SĐK 430), Nếp ré (SĐK 1062), Tai sac (SĐK 1085), Lốc nước (SĐK 2455), Nếp râu (SĐK 5129), Nếp ốc (SĐK 6192), Masurrrin (SĐK 6211), chiêm đá (SĐK 7050) với 3/5 locut xuất hiện alen có chiều dài bằng giống chuẩn kháng. Bên cạnh đó, các giống Nước mặn dạng 1 (SĐK 3470), Ngoi tía (SĐK 6203), Lúa ngoi (SĐK 6224) mặc dù có 3/5 locut xuất hiện alen có kích thước bằng Pokkali nhưng lại xuất hiện alen có kích thước bằng IR28 tại 1 đến 2 locut cịn lại.
Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn tỉ lệ % xuất hiện các dạng alen khác nhau tại các locut liên kết với QTLs chống chịu mặn sử dụng trong nghiên cứu
Ghi chú: ( + ) Xuất hiện alen có kích thước tương đương với đối chứng chuẩn kháng
( - ) Xuất hiện alen có kích thước tương đương với đối chứng chuẩn nhiễm
( * ) Xuất hiện alen có kích thước khác với các đối chứng
Đồng thời, dựa vào đồ thị hình 3.12, nhận thấy tại 5 locut SSR liên kết với QTLs/gen chống chịu mặn, các băng ADN có kích thước khơng bằng giống chuẩn kháng và chuẩn nhiễm nhiều hơn so với các băng ADN có kích thước bằng với các
0 10 20 30 40 50 60 70 80 13 18.5 8.5 20 12.5 15 41 20 33 27.5 72 40.5 71 48 60 + - * %
giống đối chứng. Số giống xuất hiện băng ADN có kích thước bằng Pokkali nhiều nhất là tại locut RM 10745 (20%) và thấp nhất là tại locut RM 8094 (8,5%). Điển hình là tại locut RM 206 và RM 8094 với tỉ lệ alen có kích thước khác với đối chứng lần lượt là 72% và 71%, tiếp đó là tại locut RM 3412 với tỉ lệ là 60%. Trong khi đó, 2 locut RM 223 và RM 10745 có nhiều giống xuất hiện alen có kích thước bằng IR28 nhất (41% và 33%). Đồng thời, tại locut RM10745 còn xuất hiện băng alen dị hợp tử ở 3 giống Nếp cúc (SĐK 2367), Nếp ông lão (SĐK 2369) và Su dạng 1 (SĐK 3416). Điều này đã chứng tỏ các băng ADN xuất hiện tại các locut nghiên cứu là rất đa dạng.
3.1.3. Xác định alen chống chịu hạn
Dựa vào các nghiên cứu của Steel và cs. (2006) ; Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu (2008, 2010, 2013); Thanh N.D và cs. (2008), Kanagaraj P. (2010), đề tài đã chọn bộ chỉ thị gồm 5 mồi SSR liên kết với QTLs/gen liên quan đến khả năng chống chịu hạn, tăng kích thước chiều dài rễ hay các tính trạng liên quan đến độ rậm và đâm sâu của rễ, tỉ lệ rễ/chồi, tỉ lệ trọng lượng khô của rễ/ chồi để tiến hành