CHƢƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2. Phương pháp
2.2.3. Phân tách các phân đoạn DNA methyl hóa và khơng methyl hóa
Để tăng tỷ lệ các đoạn DNA thuộc hệ gen lục lạp trong toàn bộ DNA tổng số đã được tách chiết, NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit được sử dụng để phân tách các phân đoạn DNA bị methyl hóa và khơng bị methyl hóa ở CpG. Theo đó, các đoạn DNA bị methyl hóa tại CpG chủ yếu thuộc hệ gen nhân sẽ được tách
ra khỏi DNA tổng số ban đầu. Khoảng 400 ng DNA tổng số sau tách chiết được sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất với các bước chính:
(1) Gắn protein MBD2 - Fc lên Magnetic Bead: NEBNext Protein A Magnetic Bead được hòa tan sử dụng pipet trong 15 phút ở 4oC. Sau đó, 6,4 µl dung dịch MBD2 - Fc được trộn với 64 µl Protein A Magnetic Bead tương ứng với lượng mẫu đầu vào là 400 ng. Hỗn hợp được trộn đều trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, chuyển sang khay từ trong 2 - 5 phút cho đến khi các hạt từ bám hoàn toàn vào thành ống và loại bỏ dịch trong suốt. Tiếp theo, 1 ml dung dịch Bind/Wash Buffer 1X lạnh được bổ sung và trộn trong 3 phút ở nhiệt độ phòng. Dung dịch được đặt lên khay từ trong 2 - 5 phút để loại dịch nổi và lặp lại bước rửa với dung dịch Bind/Wash Buffer 1X. Các hạt từ sau đó sẽ được hịa trong 64 µl dung dịch Bind/Wash Buffer 1X lạnh tương ứng với 400 ng lượng mẫu đầu vào;
(2) Phân tách các đoạn DNA bị methyl hóa và khơng bị methyl hóa ở CpG: Dung dịch Bind/Wash Buffer 5X và 64 µl Magnetic Bead đã được gắn MBD2 - Fc được bổ sung tương ứng với 400 ng DNA tổng số. Hỗn hợp được ủ và lắc trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Sau khi DNA và các hạt Magnetic Bead gắn MBD2 - Fc được ủ với nhau, ống chứa hỗn hợp được chuyển lên khay từ trong 5 phút cho đến khi các hạt từ bám hoàn toàn lên thành ống. Dịch nổi chứa DNA khơng bị methyl hóa được chuyển ra ống eppendorf mới;
(4) Tinh sạch DNA khơng bị methyl hóa: Các phân đoạn DNA không bị methyl hóa trong dịch nổi từ bước phân tách được tinh sạch sử dụng 0.9X AMPure XP Bead (Beckman Coulter) theo hướng dẫn của nhà sản xuất;
(5) Rửa giải DNA bị methyl hóa: Sau khi phân tách dịch nổi và các hạt từ trong giai đoạn thứ 3, 1 ml dung dịch Bind/Wash Buffer 1X được bổ sung để rửa các hạt từ. Tiếp theo, 150 µl dung dịch TE 1X và 15 µl dung dịch Proteinase K được bổ sung vào ống chứa hạt từ và trộn đều. Hỗn hợp được ủ tại 65o
C trong 20 phút và ly tâm ở 13.000 v/p. Ống được chuyển lên khay từ trong 2 - 5 phút để các
hạt từ bám hoàn toàn lên thành ống. Dịch nổi chứa DNA bị methyl hóa được thu hồi và tinh sạch.
(6) Kiểm tra chất lượng: Việc kiểm sốt chất lượng như kích thước, độ tinh sạch và nồng độ phân tử của các phân đoạn bị methyl hóa và phân đoạn khơng bị methyl hóa được xác định bằng hệ thống Fragment Analyzer sử dụng DNF - 488 - 33 HS dsDNA Reagent Kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các phân đoạn DNA sau khi được phân tách và tinh sạch sẽ được sử dụng để xây dựng thư viện giải trình tự DNA.
2.2.4. Tạo thƣ viện hệ gen
Các đoạn DNA bị methyl hóa và khơng bị methyl hóa ở CpG sau khi được phân tách ra từ mẫu DNA tổng số sẽ tiếp tục được phân cắt, gắn adapter, chọn lọc và tinh sạch để tạo thành thư viện phục vụ cho giải trình tự sử dụng hệ thống Ion Torrent.
(1) Phân đoạn DNA: DNA được cắt thành các đoạn ngắn để phục vụ cho việc lập thư viện trình tự sử dụng M220 Focused Ultrasonicator (Covaris Inc., Woburn, MA, USA) và microTUBE - 50 (Covaris Inc.) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. DNA được phân cắt thành các đoạn khoảng 400 bp bằng sóng siêu âm trong 60 giây;
(2) Sửa chữa đi và gắn adaptor lên DNA: Quy trình chuẩn bị thư viện trình tự được thực hiện sử dụng NEBNext Fast DNA Library Prep Set for Ion Torrent (NEB). Các thành phần của phản ứng sửa chữa đi DNA (6 µl NEBNext End Repair Reaction Buffer, 3 µl NEBNext End Repair Enzyme Mix và DNA đã phân cắt) được trộn đều trên đá và ủ trong 20 phút ở 25oC, 10 phút ở 70oC và giữ ở 4oC. Tiếp theo, quy trình gắn DNA với adapter được thực hiện bằng cách bổ sung 10 µl T4 DNA Ligase Buffer for Ion Torrent, 5 µl NEBNext DNA Library Adaptors for Ion Torrent, 1 µl Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase và 6 µl T4 DNA Ligase. Hỗn hợp được ủ trong 15 phút ở 25oC, 5 phút ở 65oC và giữ ở 4oC;
(3) Lựa chọn DNA có kích thước mong muốn: thư viện đã gắn adapter và barcode được lựa chọn theo kích thước bằng BluePippin (Sage Science). Theo đó, DNA được lựa chọn kích thước trong khoảng 450 - 540 bp sử dụng Range Mode theo hướng dẫn của nhà sản xuất;
(4) Khuếch đại và tinh sạch thư viện DNA: Thư viện DNA sau khi lựa chọn kích thước thích hợp được khuếch đại sử dụng NEBNext Fast DNA Library Prep Set for Ion Torrent Kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các thành phần của phản ứng khuếch đại (4 µl mồi, 50 µl NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix và 1 - 40 µl DNA đã gắn adapter) được trộn và PCR với chu trình nhiệt như sau: 98oC- 30 giây, 12 chu kỳ (98oC-10 giây, 58oC-30 giây, 65oC-30 giây), 65oC - 5 phút và giữ ở 4oC. Thư viện đã khuếch đại được tinh sạch 2 lần sử dụng 0,7X AMpure XP Bead.
2.2.5. Giải trình tự hệ gen lục lạp bằng hệ thống giải trình tự DNA thế hệ mới
Thư viện khuếch đại sau tinh sạch sẽ được đưa vào các chip giải trình tự sử dụng Ion Chef (Thermo Fisher Scientific) và giải trình tự trên máy Ion Torrent Personal Genome Machine (Thermo Fisher Scientific) sử dụng Ion 318 v2 chip (Thermo Fisher Scientific) và Ion PGM Sequencing 400 kit (Thermo Fisher Scientific). Hệ thống Ion Chef được sử dụng để chuẩn bị mẫu và đưa mẫu vào chip tự động sử dụng Ion PGMTM IC 200 Kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất với các bước chính:
(1) Tạo Planned Run với các thơng số liên quan đến quy trình chạy giải trình tự như loại kit sử dụng, các barcode, kiểu thư viện... sử dụng phần mềm Torrent Suite;
(2) Pha loãng mẫu thư viện, chuẩn bị Ion chip;
(4) Chạy máy Ion Chef dựa trên Planned Run đã tạo trước đó. Sau khi hồn thành quy trình chạy, chip được chuyển sang máy Ion PGM Sequencer để thực hiện giải trình tự.
Quy trình giải trình tự sử dụng Ion PGM Sequencing 400 Kit được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất với các bước chính:
(1) Chuẩn bị Ion Sphere Particle (ISP) dương tính với mẫu và đã được làm giàu: Control ISP sau khi ly tâm trong 2 giây được bổ sung trực tiếp (5 µl) vào ISP dương tính với mẫu và đã được làm giàu;
(2) Gắn Sequencing Primer: Mẫu sau đó được ly tâm trong 2 phút ở 12.000 v/p, loại bỏ dịch nổi và hịa tủa trong 12 µl Sequencing Primer. Hỗn hợp được đưa vào chu trình nhiệt trong 2 phút ở 95oC, 2 phút ở 37oC và giữ ở nhiệt độ phòng;
(3) Gắn Sequencing Polymerase vào ISP: Sau khi thực hiện quy trình kiểm tra Chip, ISP được bổ sung 3 µl Ion PGM Sequencing 400 Polymerase và ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút;
(4) Đưa mẫu lên Chip: Chip được loại bỏ dung dịch và ly tâm trong 5 giây để làm khơ hồn tồn. Hỗn hợp polymerase sau khi ủ được đưa lên Chip và ly tâm trong 30 giây. Dung dịch trong Chip được đảo đều bằng pipet và tiếp tục ly tâm trong 30 giây. Bước này được lặp lại 3 lần. Sau đó, dịch nổi được loại bỏ và chip được đưa vào máy Ion PGM Sequencer thực hiện quá trình giải trình tự.
Hiệu quả của việc phân tách các phân đoạn DNA methyl hóa và khơng methyl hóa CpG được đánh giá sử dụng Bowtie2 bằng cách mapping các đoạn đọc với trình tự tham chiếu của lồi Panax vietnamensis (KP036470) [53].
2.2.6. Lắp ráp trình tự hệ gen lục lạp
Dữ liệu thu được từ giải trình tự Ion Torrent sẽ được xử l thô trước khi đưa vào lắp ráp, chú giải và so sánh.. Các đoạn đọc single-end sẽ được sàng lọc, đánh giá về chất lượng base, độ bao phủ... sử dụng phần mềm FastQC 0.11.5 [13]. Trimmomatic 0.36 được sử dụng để cắt adapter và lọc chất lượng của các đoạn đọc
sử dụng một cửa sổ trượt (sliding window) có kích thước 15 bp và ngưỡng Phred trung bình là 20 đồng thời với việc loại bỏ những đoạn đọc ngắn hơn 100 bp [18]. MITOBim 1.7 được sử dụng để lắp ráp các đoạn đọc single-end sử dụng phương pháp mapping lặp lại với trình tự tham khảo là P.vietnamensis (KP036470) [39]. Hệ gen lục lạp sau lắp ráp và độ bao phủ (coverage) được trực quan hóa sử dụng Tablet 1.17.08.17 [66]
2.2.7. Khuếch đại và giải trình tự các vùng DNA quan trọng và cần hiệu chỉnh Khuếch đại và tinh sạch các vùng trình tự DNA bằng phƣơng pháp Khuếch đại và tinh sạch các vùng trình tự DNA bằng phƣơng pháp PCR: Một số vị trí trong hệ gen lục lạp đã lắp ráp cho kết quả khơng rõ ràng và các
vị trí thuộc vùng IR cần được hiệu chỉnh bằng hệ thống giải trình tự Sanger. Dựa trên kết quả phân tích và lắp ráp hệ gen lục lạp, các cặp mồi được thiết kế để nhân những đoạn trình tự DNA cần hiệu chỉnh. Mồi xi và mồi ngược đảm bảo các điều kiện sau: Chiều dài 18-30 nucleotide; tỷ lệ GC khoảng > 40%; mỗi mồi khơng có trình tự bắt cặp bổ sung có khả năng tạo cấu trúc kẹp tóc (hair-pin); hai mồi khơng bắt cặp bổ sung tạo primer dimer. DNA tổng số được sử dụng làm khuôn cho PCR với các cặp mồi đã thiết kế và tổng hợp. Thành phần PCR được tiến hành với thể tích là 20 µl gồm: 1X DreamTaq Buffer; 1 mM dNTPs; 2,5 μM mỗi mồi; 0,75 unit DreamTaq DNA polymerase; 50 ng DNA tổng số. PCR được thực hiện trên máy Mastercycler® pro (Eppendorf)với chu trình nhiệt như sau: 94oC - 2 phút; (94oC - 30 giây; 50-60oC (*) - 30 giây; 72oC - 60 giây) × 35 chu kì, 72oC - 5 phút, sau đó giữ ở 4o
C. (*): Nhiệt độ gắn mồi tùy thuộc vào cặp mồi tương ứng.
Tinh sạch sản ph m PCR sử dụng E.Z.N.A.® Cycle Pure Kit: Các bước tinh sạch được tiến hành theo chỉ dẫn của hãng sản xuất bao gồm các bước chính như sau:
(1) Sản phẩm PCR được trộn với 4 - 5 thể tích CP Buffer và được chuyển vào HiBind DNA Mini Column. Dịch chảy qua được loại bỏ sau khi ly tâm cột ở 13.000 v/p trong 1 phút;
(2) Cột được rửa hai lần với 700 µl Wash Buffer và ly tâm ở 13.000 v/p trong 1 phút;
(3) HiBind DNA Mini Column được làm khô bằng cách ly tâm ở 13.000 v/p trong 2 phút;
(4) DNA được rửa giải bằng cách bổ sung 30 - 50 µl Elution Buffer, ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút và ly tâm ở 13.000 v/p trong 1 phút. DNA sau tinh sạch được bảo quản ở -20o
C.
Giải trình tự DNA bằng phƣơng pháp Sanger: Trình tự của các đoạn DNA được xác định trên máy giải trình tự tự động ABI 3500 Genetic Analyzer sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit. Thành phần của PCR phục vụ giải trình tự gồm: 3,2 μM mỗi mồi, 200 ng DNA plasmid, BigDye, đệm tương ứng trong tổng thể tích 15 l với chu trình nhiệt trên máy Mastercycler® pro (Eppendorf) như sau: 96oC - 1 phút; (96oC - 10 giây, 50oC - 5 giây, 60oC - 4 phút) × 25 chu kỳ; giữ ở 4oC.
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng phương pháp tủa EtOH/EDTA:
(1) Sản phẩm PCR được bổ sung 5 l EDTA 125 mM, 60 l EtOH 100%, ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút và ly tâm 12.000 v/p trong 15 phút;
(2) Tủa DNA được rửa với 60 l EtOH 70% và ly tâm ở 10.000 vòng/ phút trong 10 phút;
(3) Tủa DNA sau đó được làm khơ, bổ sung 10 l Hi-Di Formamide và biến tính tại 95oC trong 5 phút;
(4) Các mẫu được chuyển vào các giếng của khay đựng mẫu và điện di trong ống mao quản 80 cm × 50 m với polymer POP-4 (ABI) trong hệ thống ABI 3500 Genetic Analyzer.
2.2.8. Phân tích và chú giải hệ gen lục lạp
Trình tự hệ gen lục lạp được chú giải sử dụng phần mềm Geneious 6.1 và được xây dựng thành bản đồ sử dụng OGDraw (Organellar Genome Draw) [47,57].
2.2.9. Xây dựng cây phát sinh chủng loại
Trình tự hệ gen lục lạp của sâm Ngọc Linh được so sánh sắp hàng toàn bộ (global align) sử dụng MAFFT 7.3 và sửa chữa so sánh sắp hàng cục bộ (local re- align) sử dụng MUSCLE 3.8.31 [29,46]. Ma trận trình tự DNA đã so sánh sắp hàng được đưa lên Open Science Framework (https://osf.io/ryuz6). Mơ hình thích hợp nhất với bộ dữ liệu được tìm kiếm sử dụng jModelTest 2.1.6 [24]. Trên cơ sở đó, cây phát sinh chủng loại được xây dựng sử dụng phương pháp Maximum Likelihood (ML) trong phần mềm RAxML 8.2.10 và phương pháp Bayesian trong phần mềm mrBayes 3.2.6 [79,90].
2.2.10. Tìm kiếm, phân tích và đánh giá các vùng trình tự mã vạch phân tử tiềm năng
Các chỉ thị phân tử được lựa chọn dựa trên việc đánh giá mật độ SNP trong ma trận so sánh trình tự DNA lục lạp của các loài thuộc chi Nhân sâm. SNP-sites 2.3.2 và Bedtools 2.26.0 được sử dụng để tìm ra những vị trí SNP trong ma trận so sánh trình tự lục lạp [70,77]. Những vùng trình tự có mức độ biến đổi cao nhất được sử dụng để làm chỉ thị phân tử cho sâm Ngọc Linh nói riêng và chi Nhân sâm nói chung. Cây phát sinh chủng loại với 14 chỉ thị từ lục lạp và ITS được xây dựng kết hợp và riêng rẽ sử dụng RAxML. Trong phân tích với phần mềm mPTP (multi-rate Poisson Tree Processes), thuật toán MCMC được thực hiện với hai chuỗi MCMC và Likelihood Ratio Test đặt ở 0.01 [45].
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tách chiết, kiểm tra chất lƣợng DNA tổng số mẫu sâm Ngọc Linh và phân tách các phân đoạn DNA bị methyl hóa, khơng bị methyl hóa 3.1.1. Tách chiết và kiểm tra chất lƣợng DNA tổng số mẫu sâm Ngọc Linh
DNA tổng số sau tách chiết được kiểm tra, đánh giá về chất lượng trên gel agarose 0,8% (Hình 3.1). Kết quả điện di cho thấy DNA tổng số sau tách chiết bị đứt gãy tạo ra vệt smear nhưng vẫn giữ được các đoạn có kích thước lớn (> 10 kb) và không bị lẫn RNA. Độ phân mảnh và kích thước các phân đoạn được kiểm tra bằng hệ thống Fragment Analyzer (Advanced Analytical Technologies, Inc., Ankeny, USA) sử dụng High Sensitivity genomic DNA Reagent Kit (50 - 40.000 bp). Kết quả cho thấy DNA tổng số thu được có kích thước các phân đoạn trung bình ở 14.072 bp và nồng độ đạt 4,93 ng/µl (Hình 3.1). Dựa vào kết quả điện di kết hợp với kiểm tra nồng độ, độ phân mảnh, mẫu DNA tổng số của sâm Ngọc Linh đạt chất lượng để đưa vào các bước phân tích, nghiên cứu tiếp theo.
1 M
Nồng độ: 4,93 ng/µl
(A) (B)
Hình 3.1. Kết quả điện di (A) và kiểm tra chất lƣợng với Fragment Analyzer (B) mẫu DNA tổng số sau tách chiết. Giếng 1: DNA tổng số mẫu sâm Ngọc Linh; giếng M: Thang chuẩn DNA 1 kb.
3.1.2. Phân tách các phân đoạn DNA bị methyl hóa và khơng bị methyl hóa trên CpG
Ở các lồi thuộc chi Nhân sâm thì tỷ lệ DNA thuộc hệ gen lục lạp chỉ chiếm 1 - 5% so với toàn bộ hệ gen gây khó khăn cho quá trình giải trình tự shotgun [68,71]. Vì vậy, để tăng hiệu quả cho q trình giải trình tự, chúng tơi đã tận dụng đặc điểm về độ methyl hóa thấp trên hệ gen lục lạp so với hệ gen nhân để phân tách hai loại DNA này [101]. NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit có IgG1 kết hợp với domain gắn CpG - methyl hóa (MBD2 - Fc) được sử dụng để giữ những phân đoạn DNA bị methyl hóa trên CpG lên trên hạt từ, tách khỏi những phân đoạn khơng bị methyl hóa ở dịch nổi. Việc kiểm sốt chất lượng như kích thước, độ tinh sạch và nồng độ của các phân đoạn DNA bị methyl hóa và khơng bị methyl hóa được xác định bằng hệ thống Fragment Analyzer (Hình 3.2).