CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.6. xuất bộ chỉ thị phân tử tiềm năng khai thác từ trình tự hệ gen lục lạp sâm
Ngọc Linh
Phân tích phát sinh chủng loại cho thấy hệ gen lục lạp có khả năng định loại chính xác và rõ ràng các loài thuộc chi Nhân sâm nhờ vào sự biến thiên lớn trong trình tự. Tuy nhiên, việc giải trình tự tồn bộ hệ gen lục lạp của các lồi thuộc chi này khơng phải là giải pháp hữu hiệu cho định loại phân tử do giá thành cao, đ i hỏi nhiều loại trang thiết bị và cơng sức. Vì vậy, từ trình tự hồn chỉnh kết hợp với phân tích phát sinh chủng loại, chúng tơi đã tìm kiếm các vùng gen có độ biến thiên thích hợp để làm chỉ thị phân tử phục vụ cho định loại các loài thực vật chi Nhân sâm. Để tìm kiếm và đánh giá các chỉ thị phân tử trên hệ gen lục lạp, đầu tiên, chúng tơi tiến hành tìm kiếm các SNP trên ma trận so sánh trình tự hệ gen lục lạp các loài thuộc chi Nhân sâm sử dụng SNP-sites 2.3.2. Các marker được lựa chọn bằng cách đánh giá mật độ SNP sử dụng Bedtools 2.26.0 dựa trên ma trận so sánh từ SNP-sites 2.3.2. Kết quả phân tích cho thấy có 2.052 SNP trên tồn bộ ma trận so sánh. Chúng tôi đã xác định được 3 vùng thích hợp để làm chỉ thị phân tử: trnQ-rps16, trnE- trnM, vùng chứa cả psbM-trnD và trnS-trnG. Mỗi vùng này có trung bình 83 SNP
trong chi Nhân sâm.
Cây phát sinh chủng loại được xây dựng cho toàn bộ hệ gen lục lạp, 15 chỉ thị lục lạp (đã công bố trước đây và mới đề xuất) và một vùng gen nhân ITS sử dụng phương pháp ML với thuật toán MCMC và giá trị Likelihood Ratio Test là 0.01 trong phần mềm mPTP. Cây phát sinh chủng loại đưa ra bởi mPTP sẽ cho biết các loài, nhánh nào được đánh giá là tin cậy và có sự phân biệt lồi rõ ràng với các lồi khác. Hình 3.10 thể hiện phân tích mPTP với những tồn bộ hệ gen lục lạp và
bộ chỉ thị kết hợp được đề xuất trong nghiên cứu. Trong đó, những nhánh có màu đỏ thể hiện cho sự phân biệt rõ ràng giữa các lồi hay độ chính xác của việc định loại.
(A)
(B)
Hình 3.10. Kết quả phân tích phát sinh chủng loại với mPTP sử dụng toàn bộ hệ gen lục lạp (A) và kết quả phân tích phát sinh chủng loại với ML sử dụng kết hợp 4 chỉ thị (trnQ-rps16, trnE-trnM, psbM-trnD và trnS-trnG) (B)
Các phân tích mPTP được tổng hợp để đánh giá hiệu quả định loại của các vùng gen đã được công bố và mới đề xuất. Bảng 3.1 tổng hợp kết quả đánh giá về số vị trí biến đổi, tỷ lệ phần trăm của vùng biến đổi trên toàn bộ chiều dài chỉ thị và số lượng lồi được phân loại đúng trong phân tích mPTP. Phân tích phát sinh chủng loại dựa trên các chỉ thị đơn lẻ này có thể phân biệt hầu hết các nhánh lồi. Trường hợp ngoại lệ là cặp loài P. quinquefolius và P. ginseng, P. bipinnatifidus và P. stipuleanatus với giá trị bootstrap kém hơn và được phỏng đoán là các nhánh đơn.
Tuy nhiên, phân tích phát sinh chủng loại bằng ML với các marker kết hợp cho khả năng phân biệt tất cả các nhánh trừ P. bipinnatifidus và P. stipuleanatus (Hình 3.10).
Bảng 3.1. Tỷ lệ các vùng biến đổi (màu cam) và tình trạng phân loại thành cơng (màu xanh) trong phân tích mPTP với mỗi marker phân tử
Việc định loại các lồi sâm tương đối phức tạp vì các sự kiện lai và tiến hóa. Trong 16 chỉ thị đã phân tích, chỉ có 4 chỉ thị mới đề xuất có thể được sử dụng để phân biệt ít nhất là 6 loài thuộc chi Nhân sâm. Bốn chỉ thị phân tử này thuộc các vùng gen có độ biến thiên và cấu trúc thích hợp để phân loại các loài sâm. Từ kết quả phân tích này, chúng tơi tiến hành thiết kế 4 cặp mồi phục vụ cho khuếch đại các vùng DNA lục lạp có khả năng làm chỉ thị phân tử cho định loại sâm Ngọc Linh và các loài thuộc chi Nhân sâm (Bảng 3.2). Phân tích mPTP cho thấy với những nhóm lồi/chi phức tạp như vậy, chỉ thị phân tử DNA lục lạp riêng rẽ thường khơng có đủ khả năng để phân loại. Tuy nhiên, chúng tôi nhận thấy vùng gen tiềm năng nhất cho định loại từ chỉ thị đơn là trnQ-rps16 do có đủ độ biến thiên để phân loại hầu hết các loài (Bảng 3.1). Hơn nữa, việc sử dụng kết hợp các chỉ thị luôn cho kết quả phân loại tốt vì các phân tích mPTP thích hợp hơn với các phân tích đa chỉ thị [45]. Ma trận liên kết với 2, 3 hoặc 4 chỉ thị làm tăng tính hiệu quả trong việc định loại các lồi thuộc chi Nhân sâm và đặc biệt là những lồi có quan hệ rất gần gũi (Hình 3.10, Bảng 3.1).
Bảng 3.2. Trình tự mồi khuếch đại các chỉ thị phân tử đƣợc lựa chọn
Cặp mồi Trình tự (5’ - 3’) Tm Kích thƣớc sản ph m PCR trnQ-rps16 (vị trí 7338) GAAGATTTAGGTCCTTAGTCGTTCG 59,3 575 GATTCAGCATTCCCAGAGAATTGG 60,0 trnS-trnG (vị trí 10169) GCCGCTTTAGTCCACTCAGC 61,4 659 GTGTTGACATTTTTCGTGGGGG 60,5 trnE-trnM (vị trí 82004) AATATTCAGACCTCGCGGCC 60,3 576 GGCTCAAGCAAAACACCCAA 59,5 psbM-trnD (vị trí 35413) GAGTGGTTGGTCCGTCAGAA 59,6 513 CATGGCGTTACTCTACCGCT 59,9
KẾT LUẬN
1. DNA lục lạp của sâm Ngọc Linh đã được giải trình tự thành cơng sử dụng phương pháp phân tách DNA bị methyl hóa và khơng bị methyl hóa trên CpG.
2. Trình tự DNA lục lạp sau khi lắp ráp và phân tích có kích thước 156.099 bp với cách sắp xếp, phân bố các gen tương tự như các lồi thuộc chi Nhân sâm đã cơng bố trên GenBank.
3. Bốn chỉ thị phân tử đã được phát hiện từ trình tự DNA lục lạp có độ biến thiên thích hợp để phân loại sâm Ngọc Linh với các loài thuộc chi Nhân sâm.
KIẾN NGHỊ
1. Thử nghiệm khai thác các chỉ thị phân tử tìm kiếm được để phân loại sâm Ngọc Linh và các loài thuộc chi Nhân sâm.
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
1. Manzanilla V.1, Kool A.1, Nguyen Nhat L.2, Nong Van H.2, Le Thi Thu H.2§, de Boer H.J.1§ (2017). “Plastome phylogenomics resolves relationships in Panax
and identifies markers for molecular identification”. BMC Evolutionary Biology (Đã được chấp nhận đăng, đang chờ in).
2. Lê Thanh Hương, Nguyễn Nhật Linh, Bùi Mạnh Minh, Hà Hồng Hạnh, Huỳnh Thị Thu Huệ, Nông Văn Hải, Hà Văn Huân, Lê Thị Thu Hiền (2017). “Ứng dụng mã vạch DNA hỗ trợ định loại loài một số mẫu sâm thuộc chi Nhân sâm (Panax L.)”. Tạp chí Cơng nghệ sinh học 15(1): 63-72.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tham khảo tiếng Việt:
1. Dương Tấn Nhựt, Hoàng Xuân Chiến, Nguyễn Bá Trực, Nguyễn Bá Nam, Trần Xuân Tình, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Văn Bình, Vũ Thị Hiền, Trịnh Thị Hương, Nguyễn Cửu Thành Nhân, Lê Nữ Minh Thùy, Lý Thị Mỹ Nga, Thái Thương Hiền, Nguyễn Thành Hải (2010). “Nhân giống vơ tính cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”. Tạp chí Cơng nghệ sinh học,
8(3B): 1211-1219.
2. Lã Đình Mỡi, Châu Văn Minh, Trần Văn Sung, Phạm Quốc Long, Phan Văn Kiệm, Trần Huy Thái, Trần Minh Hợi, Ninh Khắc Bản, Lê Mai Hương (2013). "Họ Nhân sâm (Araliaceae Juss.) - Nguồn hoạt chất sinh học đa dạng và đầy triển vọng ở Việt Nam". Hội nghị khoa học toàn quốc về Sinh thái và
tài nguyên sinh vật lần thứ 5: 1152-1158.
3. Lê Thị Thu Hiền, Hugo de Boer, Nông Văn Hải, Lê Thanh Hương, Nguyễn Mai Hương, Lars Bjork (2012). "Mã vạch phân tử DNA và hệ thống dự liệu mã vạch sự sống". Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 10(3): 393-405.
4. Nguyễn Cẩm Dương (2010). “Phân tích đa dạng di truyền nguồn tài nguyên một số loài cây dược liệu ở Việt Nam bằng một số chỉ thị ADN”. Luận án Thạc sỹ khoa học. Đại học quốc gia Hà Nội.
5. Nguyễn Ngọc Dung (1995). “Nhân giống sâm Ngọc Linh (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.) bằng con đường sinh học”. Nhà xuất bản Nông
nghiệp: 43-100.
6. Nguyễn Tập, Phạm Thanh Huyền, Lê Thanh Sơn, Ngô Đức Phương, Võ Văn Trại, Đinh Đoàn Long, Hoàng Thị H a (2007). "Sử dụng chỉ thị ADN (RAPD-PCR) trong nghiên cứu đa dạng di truyền và góp phần phân loại một số lồi cây thuốc định hướng cơng tác bảo tồn và tiêu chuẩn hóa dược liệu ở Việt Nam". Hội nghị Dược liệu toàn quốc lần thứ hai: 288-301.
7. Nguyễn Thị Phương Trang, Lê Thanh Sơn, Nguyễn Giang Sơn, Phan Kế Long (2011). "Phát hiện về một loài sâm mới Panax sp. (Araliaceae) ở Việt
Nam". Tạp chí Dược học, 10: 59-63.
8. Nguyễn Văn Đạt, Trần Thị Phương Anh (2013). "Bước đầu nghiên cứu xây dựng khóa định loại các chi trong họ Ngũ gia bì (Araliaceae) ở Việt Nam".
Hội nghị khoa học toàn quốc về Sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 5:
44-51.
9. Phan Kế Long, Vũ Đình Duy, Phan Kế Lộc, Nguyễn Giang Sơn, Nguyễn Thị Phương Trang, Lê Thị Mai Linh, Lê Thanh Sơn (2014). “Nghiên cứu đặc điểm di truyền của các mẫu sâm thu ở Lai Châu trên cơ sở phân tích trình tự nucleotide vùng gen matK và ITS-rRNA”. Tạp chí Cơng nghệ sinh học,
12(2): 327-337.
10. Sách Đỏ Việt Nam. Phần II. Thực vật (2007). Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội.
11. Vũ Huyền Trang, Hoàng Đăng Hiếu, Chu Hoàng Hà (2013). “Nghiên cứu xây dựng mã vạch DNA cho việc phân loại nhận dạng cây sâm Ngọc Linh”.
Hội nghị khoa học công nghệ sinh học toàn quốc: 1100-1104.
Tài liệu tham khảo tiếng Anh:
12. Ali M.A., Al-Hemaid F.M., Lee J., Choudhary R.K., Pandey A.K., Al-Harbi N.A. (2012). "Assessing nrDNA ITS2 sequence based molecular signature of ginseng for potential in quality control of drug". African Journal of Pharmacy and Pharmacology, 6(39): 2775-2781.
13. Andrews S., (2010). “FastQC: a quality control tool for high throughput
sequence data”. Available online at:
http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc.
14. Ansorge W., Sproat B.S., Stegemann J., Schwager C. (1986). "A non- radioactive automated method forDNA sequence determination". Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 13(6): 315-323.
15. Ansorge W., Sproat B., Stegemann J., Schwager C., Zenke M. (1987). "Automated DNA sequencing: ultrasensitivedetection of fluorescent bands during electrophoresis". Nucleic Acids Research, 15(11): 4593-4602.
16. Attele A.S., Wu J.A., Yuan C.S. (1999). “Ginseng pharmacology: multiple constituents and multiple actions”. Biochemical Pharmacology, 58: 1685– 1693.
17. Becker C., Shutov A.D., Nong V.H., Senyuk V.I., Jung R., Horstmann C., Fischer J., Nielsen N.C., Muntz K. (1995). "Purification, cDNA cloning and characterization of proteinase B, an asparagine-specific endopeptidase from germinating vetch (Vicia sativa L.) seeds". European Journal of Biochemistry, 228(2): 456-462.
18. Bolger A.M., Lohse M., Usadel B. (2014). “Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data”. Bioinformatics, 30(15): 2114-2120.
19. Brady, A. and Salzberg S. (2011). “PhymmBL expanded: confidence scores, custom databases, parallelization and more”. Nature methods, 8 (5): 367-367. 20. Brozynska M., Furtado A., Henry R.J. (2014). “Direct chloroplast sequencing: Comparison of sequencing platforms and analysis tools for whole chloroplast barcoding”. PLoS One, 9(10): e110387.
21. Chen S., Luo H., Li Y., Sun Y., Wu Q., Niu Y., Song J., Lv A., Zhu Y., Sun C., Steinmetz A., Qian Z. (2011). "454 EST analysis detects genes putatively involved in ginsenoside biosynthesis in Panax ginseng". Plant Cell Reports,
30(9): 1593-1601.
22. Chen X., Liao B., Song J., Pang X., Han J., Chen S. (2013). "A fast SNP identification and analysis of intraspecific variation in the medicinal Panax
species based on DNA barcoding". Gene, 530(1): 39-43.
23. Curci P.L., De Paola D., Danzi D., Vendramin G.G., Sonnante G. (2015). “Complete chloroplast genome of the multifunctional crop globe Artichoke and comparison with other Asteraceae”. PLoS One, 10(3): e0120589.
24. Darriba, D., Taboada, G. L., Doallo, R., Posada, D. (2012). jModelTest 2: more models, new heuristics and parallel computing. Nature methods, 9(8): 772-772.
25. Dong W., Liu H., Xu C., Zuo Y., Chen Z., Zhou S. (2014). “A chloroplast genome strategy for designing taxon specific DNA mini-barcodes: a case study on ginsengs”. BMC Genetics, 15: 138.
26. Duong T.N., Nguyen P.H., Hoang X.C., Tran C.L., Bui T.V., Lam B.T. (2012a). “I culture of petiole longitudinal thin cell layer explants of Vietnamese ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) and preliminary analysis of saponin content”. International Journal of Applied Biology and Pharmaceutical Technology: 178-190.
27. Duong T.N., Vinh B.V.T., Hien T.T., Huy N.P., Nam N.B., Chien H.X. (2012b). “Effects of spermidine, proline and carbohydrate sources on somatic embryogenesis from main root transverse thin cell layers of Vietnamese ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”. African Journal of Biotechnology, 11(5): 1084-1091.
28. Dyal S.D., Brown M.T., Johnson P.J. (2004). “Ancient invasions: from endosymbiont to organelles”. Science, 304: 253-257.
29. Edgar R.C. (2004). “MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput”. Nucleic Acids Research 32(5): 1792-1797. 30. Edwards A., Voss H., Rice P., Civitello A., Stegermann J., Schwager C.,
Zimmermann J., Erfle H., Caskey CT., Ansorge W. (1990). "Automated DNA sequencing of the human HPRT locus".Genomics, 6(4): 593-608. 31. Edwards, S.V. (2009). “Is a new and general theory of molecular systematics
emerging?”. Evolution, 63 (1): 1-19.
32. Ferrarini M., Cestaro A., Sargent D.J., Moretto M., Ward J.A., Šurbanovski N., Stevanović V., Giongo L., Viola R., Cavalieri D., Velasco R., Cestaro A., Sargent D.J. (2013). “An evaluation of the PacBio RS platform for
sequencing and de novo assembly of a chloroplast genome”. BMC Genomics, 14: 670-670.
33. Flusberg B.A., Webster D.R., Lee J.H., Travers K.J., Olivares E.C., Clark T.A., Turner S.W. (2010). “Direct detection of DNA methylation during single-molecule, real-time sequencing”. Nature Methods, 7(6), 461-465. 34. Forgetta V., Leveque G., Dias J., Grove D., Lyons Jr R., Genik S.,
Kieleczawa J. (2013). “Sequencing of the Dutch elm disease fungus genome using the Roche/454 GS-FLX Titanium System in a comparison of multiple genomics core facilities”. Journal of Biomolecular Techniques: JBT, 24(1),
39.
35. Fushimi H., Komatsu K., Isobe M., Namba T. (1996). "18S ribosomal RNA gene sequences of three Panax species and the corresponding ginseng
drugs". Biological and Pharmaceutical Bulletin, 19(11): 1530-1532.
36. Goodwin S., McPherson J.D., McCombie W.R. (2016). “Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies”. Nature Reviews Genetics, 17(6): 333-351.
37. Gupta P.K., Xu Y. (2008). “Genomics of major crops and model plant species”. International Journal of Plant Genomics,
http://dx.doi.org/10.1155/2008/171928.
38. Ha W.Y., Shaw P.C., Liu J., Yau F.C., Wang J. (2002). "Authentication of
Panax ginseng and Panax quinquefolius using amplified fragment length
polymorphism (AFLP) and directed amplification of minisatellite region DNA (DAMD)". Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50(7): 1871- 1875
39. Hahn C., Bachmann L., Chevreux B. (2013). “Reconstructing mitochondrial genomes directly from genomic next-generation sequencing reads - a baiting and iterative mapping approach”. Nucleic Acids Research, 41(13): e129- e129.
40. Hollingsworth M.L., Andra Clark A., Forrest L.L., Richardson J., Pennington R.T., Long D.G., Cowan R., Chase M.W., Gaudeul M., Hollingsworth P.M. (2009). "Selecting barcoding loci for plants: Evaluation of seven candidate loci with species-level sampling in three divergent groups of land plants".
Molecular Ecology Resources, 9(2): 439-457.
41. Hollingsworth P.M. (2008). "DNA barcoding plants in biodiversity hot spots: progress and outstanding questions". Heredity (Edinb), 101(1): 1-2
42. Jansen R.K., Raubeson L.A., Boore J.L., dePamphilis C.W., Chumley T.W., Haberle R.C., Wyman S.K., Alverson A.J., Peery R., Herman S.J., Fourcade H.M., Kuehl J.V., McNeal J.R., Leebens-Mack J, Cui L. (2005). “Methods for obtaining and analyzing whole chroloplast genome sequences”. Methods
in Enzymology, 395: 348-384.
43. Jia L., Zhao Y. (2009). “Current Evaluation of the Millennium Phytomedicine - Ginseng (I): Etymology, Pharmacognosy, Phytochemistry, Market and Regulations”. Current Medicinal Chemistry, 16(19): 2475–2484. 44. Jill H.C., Langdale, J.A. (2006). A step by step guide to phylogeny
reconstruction. The Plant Journal, 45(4): 561-572.
45. Kapli P., Lutteropp S., Zhang J., Kobert K., Pavlidis P., Stamatakis A., Flouri T. (2017). “Multi-rate poisson tree processes for single-locus species delimitation under Maximum Likelihood and Markov Chain Monte Carlo”.
Bioinformatics, 33(11): 1630-1638.
46. Katoh K., Misawa K., Kuma K., Miyata T. (2002). “MAFFT: a novel method for rapid multiple sequence alignment based on fast Fourier transform”. Nucleic Acids Research, 30(14): 3059-3066.
47. Kearse M., Moir R., Wilson A., Stones-Havas S., Cheung M., Sturrock S.,
Buxton S., Cooper A., Markowitz S., Duran C., Thierer T., Ashton B., Mentjies P., Drummond A. (2012). “Geneious Basic: an integrated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data”. Bioinformatics, 28(12): 1647-1649.
48. Kim K.J., Lee H.L. (2004). "Complete chloroplast genome sequences from Korean ginseng (Panax schinseng Nees) and comparative analysis of sequence evolution among 17 vascular plants". DNA Research, 11: 247-261. 49. Komatsu K., Zhu S., Fushimi H., Qui T., Cai S., Kadota S. (2001).
"Phytogenetic analysis based on 18S rRNA gene and matK gene sequences
of Panax vietnamensis and five related species". Planta Medica, 67(5): 461- 465
50. Kress W.J., Wurdack K.J., Zimmer E.A., Weigt L.A., Janzen D.H. (2005). "Use of DNA barcodes to identify flowering plants". Proceeding of the National Academy of Sciences USA, 102(23): 8369-8374.
51. Ku C., Chung W.C., Chen L.L., Kuo C.H. (2013). "The complete plastid genome sequence of Madagascar Periwinkle Catharanthus roseus (L.) G.
Don: Plastid genome evolution, molecular marker identification, and