CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.7. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩnSalmonella
Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Salmoenlla hết sức phức tạp, bao gồm 3 loại chính: Kháng nguyên O (O- Antigen): Kháng nguyên thân. Kháng nguyên H (H - Antigen): Kháng nguyên lông. Kháng nguyên K (K- Antigen) hay kháng nguyên vỏ.
Kháng nguyên thân O (O- Antigen):
Kháng nguyên O nằm ở thành tế bào vi khuẩn, có cấu trúc Lipopolysaccharide (LPS) là thành phần chính cấu tạo nên lớp màng ngoài của thành tế bào vi khuẩn gram âm. Kháng nguyên O chịu nhiệt (Heat-stable) và kháng cồn, bị biến tính khi sử lý bằng formaldehyde. Kháng ngun O gồm 2 nhóm chính: - Polysaccharid khơng có nhóm hydro, khơng mang tính đặc trƣng của kháng nguyên và chỉ tạo sự khác biệt về hình thái khuẩn lạc từ dạng S (Smooth) sang dạng R (Rough) và dẫn đến giảm độc lực của vi khuẩn (Selbitz và cs, 1995 [69]).
- Polysaccharid nằm ở ngồi có nhóm hydro quyết định tính kháng nguyên và đặc trƣng cho từng serotyp. Kháng nguyên O đƣợc xem nhƣ là một nội độc tố (Endotoxin) mà nó đƣợc cấu tạo bởi nhóm hỗn hợp glyco- polypeptid có thể tìm thấy ở màng ngoài của vỏ bọc vi khuẩn. Theo CIRAD (2006)[37], kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella có 67 loại chính, đƣợc chia thành hơn 50 nhóm, số cịn lại đóng vai trị phụ.
Kháng nguyên lông H (H- Antigen):
- Kháng nguyên H (H-Antigen) là protein nằm trong thành phần lông của vi khuẩn, là loại kháng nguyên không chịu nhiệt (Heat labile), rất kém bền vững so với kháng nguyên O, bị phá hủy ở nhiệt độ 60oC sau 1 giờ, dễ phá hủy bởi cồn và axit yếu (Nguyễn Nhƣ Thanh và cs, (1997)[16]).Kháng nguyên H không quyết định yếu tố độc lực của vi khuẩn cũng nhƣ khơng có ý nghĩa trong việc tạo ra miễn dịch phịng bệnh, nhƣng nó có ý nghĩa quan trọng trong việc xác định giống loài của vi khuẩn.
- Kháng nguyên H gồm có 2 pha:
Pha 1: có tính đặc hiệu, gồm 28 loại kháng nguyên đƣợc biểu thị bằng chữ mẫu La tinh thƣờng: a,b,c,d,...,z. Pha 2: Khơng có tính đặc hiệu, gồm 6 loại đƣợc biểu thị bằng chữ số Ả rập: 1,2,3,4,5,6 hay la tinh thƣờng: e,n,x,...Tuy nhiên, trong từng tế bào vi khuẩn riêng biệt, luôn luôn chỉ xuất hiện từng pha, bởi vậy mà trong chẩn đoán, để đạt đƣợc một cơng thức kháng ngun hồn chỉnh cho Salmonella
phải thay đổi pha. Có các lồi Salmonella nhƣ S.typhisuishoặc S.enteritidis.. . thì chỉ tạo 1 pha.
Kháng nguyên vỏ (K- Antigen) (hay Vi- Antigen):
Theo Quinn và cs (2004)[66], kháng nguyên vỏ chỉ có ở một số lồi nhƣ
S.typhi, S.paratyphi., S.dublin cũng có thể mang kháng nguyên vỏ. Kháng nguyên K
có thể làm che các kháng nguyên thân O. Cũng theo tác giả, nếu đun sơi huyền dịch của các lồi Salmonella này trong 10 đến 12 phút sẽ phá hủy đƣợc kháng nguyên
vỏ. Kháng nguyên vỏ là một loại kháng nguyên có khả năng ngƣng kết kháng thể O khi phát triển nhiều. Kháng nguyên này chỉ gặp ở 2 serotyp là : S.typhi và
S.paratyphi C. Ký hiệu kháng nguyên Vi trong công thức kháng nguyên thƣờng
đứng sau kháng nguyên O. Theo sơ đồ của Kauffmann – White, công thức kháng nguyên của S.paratyphi C là: 6,7, Vi: -1,5 và S.Typhi là: 9, 12, Vi: c,d. Trong 3
kháng nguyên chủ yếu trên, kháng nguyên O và kháng nguyên H là 2 loại kháng nguyên có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán.
1.8. Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Salmonella.
1.8.1. Các yếu tố không phải là độc tố.
1.8.1.1. Kháng nguyên O.
Thành phần hóa học, cấu trúc kháng nguyên O đều ảnh hƣởng tới độc lực của vi khuẩn Salmonella. Cụ thể là: S.typhimuriumnếu thay đổi thành phần kháng
nguyên từ công thức 1, 4, 12 sang 1, 9, 12 thì 30 vi khuẩn từ dạng có độc lực chuyển sang dạng khơng có độc lực (Valtonen, 1977 [78]). Kháng nguyên O là yếu tố độc lực giúp vi khuẩn chống lại khả năng phòng vệ của vật chủ, giúp vi khuẩn phát triển trong tế bào tổ chức, chống lại sự thực bào của đại thực bào (Morris và cs, 1976 [59]). Kháng nguyên O khích thích các cơ quan đáp ứng miễn dịch hình thành kháng thể đặc hiệu ngƣng kết với kháng nguyên tƣơng ứng. Cơ chế phòng vệ này giúp cơ thể vật chủ chống lại quá trình tái xâm nhập của vi khuẩn. Đến nay, ngƣời ta đã xác định đƣợc trên 3000 serotyp kháng nguyên O của Salmonella, thành phần kháng nguyên của vi khuẩn S.choleraesuis gồm: O6, O7; S.typhimurium gồm: O1,
O4, O5, O12 ; S.enteritidis gồm: O1, O9, O12 .
1.8.1.2. Kháng nguyên H.
Kháng nguyên H khơng có ý nghĩa trong việc tạo ra miễn dịch phịng bệnh, cũng khơng quyết định yếu tố độc lực, tuy vậy nó có vai trị bảo vệ cho vi khuẩn khơng bị tiêu diệt bởi q trình thực bào, giúp vi khuẩn sống và nhân lên trong các tế bào đại thực bào, cũng nhƣ trong tế bào gan và thận (Weinstein và cs, 1984 [81]).
1.8.1.3. Kháng nguyên K.
Bản chất hóa học của kháng nguyên K là polysaccharid nhƣng thực chất chúng chỉ là thành phần của kháng nguyên O. Kháng nguyên K tạo hàng rào bảo vệ
giúp vi khuẩn chống lại tác động ngoại cảnh và hiện tƣợng thực bào (Nguyễn Nhƣ Thanh, 2001[16]).
1.8.1.4. Yếu tố bám dính.
Theo Jones và Richardson (1981)[52] khả năng bám dính của vi khuẩn
Salmonella lên tế bào nhung mao ruột là bƣớc khởi đầu quan trọng trong quá trình
gây bệnh. Hiện tƣợng bám dính của vi khuẩn lên bề mặt tế bào vừa mang tính chất lý hóa, vừa mang tính chất sinh học và đƣợc thực hiện theo 3 bƣớc:
- Bƣớc 1: Vi khuẩn liên kết từng phần với bề mặt tế bào, thực hiện q trình này, địi hỏi vi khuẩn phải có khả năng di động.
- Bƣớc 2: Là q trình hấp phụ, phụ thuộc vào đặc tính bề mặt của vi khuẩn và tế bào mà vi khuẩn bám dính và đƣợc thực hiện theo hƣớng thuận nghịch với sự tƣơng hỗ của những tác động khác nhau.
- Bƣớc 3: Là q trình tƣơng tác giữa yếu tố bám dính của vi khuẩn với các điểm tiếp nhận trên bề mặt tế bào. Yếu tố bám dính của vi khuẩn đƣợc sắp xếp trên các fimbriae.
Theo Lê Văn Tạo (1993)[13], trên mỗi tế bào vi khuẩn Salmonella có từ 250- 400 fimbriae, chúng giúp vi khuẩn bám dính vào tế bào nhung mao ruột non để gây bệnh.Đỗ Trung Cứ và cs (2003)[9] đã công bố: S.typhimurium phân lập từ lợn mắc bệnh phó thƣơng hàn có khả năng bám dính lên bề mặt tế bào vero với tỷ lệ cao (từ 70,76% - 93,48%). Kết quả này tƣơng đƣơng với khả năng bám dính của chủng
S.typhimurium chuẩn.
1.8.1.5. Yếu tố xâm nhập.
Theo Finlay và cs (1988)[47], khả năng xâm nhập vào tế bào có nhân hoặc lớp niêm mạc của đƣờng ruột là đặc tính của một số chủng Salmonella có độc lực. Các biến chủng Salmonella khơng có khả năng xâm nhập vào tế bào thƣờng là các chủng khơng có độc lực. Sau khi tiếp cận tế bào vật chủ, vi khuẩn Salmonella tác
động làm tăng hàm lƣợng Ca2+
nội bào, hoạt hóa Actin Depolimeriring Enzyme, làm thay đổi cấu trúc, hình dạng các sợi actin, biến đổi màng tế bào, dẫn đến hình thành giả túc bao vây tế bào vi khuẩn dƣới dạng các không bào chứa vi khuẩn. Sau
đó vi khuẩn Salmonella xâm nhập đƣợc vào trong tế bào, tồn tại, tiếp tục nhân lên với số lƣợng lớn, phá vỡ tế bào vật chủ, sản sinh độc tố đƣờng ruột (Enterotoxin) và gây tiêu chảy cho vật chủ (Frost và cs, 1970[48]).
1.8.1.6. Khả năng tổng hợp sắt.
Theo Benjamin (1985)[32], khả năng tổng hợp sắt là một yếu tố giúp vi khuẩn Salmonella tăng nhanh về số lƣợng, làm suy yếu khả năng chống đỡ của vật chủ do bị thiếu sắt. Cũng theo tác giả, vi khuẩn Salmonella có phản ứng với sự thay đổi cơ chế chu chuyển sắt; khi quá trình tổng hợp sắt bị ức chế, chúng sẽ chuyển toàn bộ protein màng điều phối sắt lên bề mặt của tế bào vi khuẩn, làm cho khả năng hấp thu sắt tăng cƣờng một cách rõ rệt.
1.8.1.7. Khả năng kháng kháng sinh.
Khi vi khuẩn có sẵn những yếu tố gây bệnh, khả năng kháng kháng sinh là một trong các yếu tố quan trọng giúp cho vi khuẩn kháng lại các yếu tố bất lợi của môi trƣờng xung quanh. Hầu hết các chủng Salmonella có khả năng kháng lại một
hoặc nhiều loại kháng sinh.
1.8.2. Các yếu tố gây bệnh là độc tố.
Nếu nhƣ các yếu tố gây bệnh không phải là độc tố là những tác nhân gián tiếp, quan trọng trong quá trình sinh bệnh của vi khuẩn Salmonella, thì các yếu tố
gây bệnh là độc tố lại là tác nhân trực tiếp quyết định quá trình sinh bệnh. Các yếu tố gây bệnh là độc tố của Salmonella bao gồm: nội độc tố (Endotoxin), ngoại độc tố đƣờng ruột (Enterotoxin) và độc tố tế bào (Cytotoxin) (Finlay và Falkov, 1988[47]).
1.8.2.1. Độc tố đƣờng ruột (Enterotoxin).
Độc tố đƣờng ruột của vi khuẩn Salmonella có hai thành phần chính: Độc tố thẩm xuất nhanh RPF (Rapid Permeability Factor) và độc tố thẩm xuất chậm DPF (Delayed Permeability Factor) (Peterson, 1980 [62]).
- Yếu tố thẩm xuất nhanh:theo Clarke và cs (1988)[38], độc tố thẩm xuất nhanh có cấu trúc thành phần giống với độc tố chịu nhiệt của vi khuẩn E.coli (Heat- stabile toxin: ST). Yếu tố thẩm xuất nhanh giúp Salmonella xâm nhập vào tế bào
làm trƣơng tế bào CHO (Chinese Hamster Ovary cell). ST có khả năng chịu đƣợc nhiệt độ 100oC trong 4 giờ, bền vững ở nhiệt độ thấp, có thể bảo quản ở -20oC. Cấu trúc phân tử gồm nhiều polysaccharide và một số chuỗi polypeptide. Độc tố thẩm xuất nhanh kích thích lên hệ thống men Guanylate Cyclase trong tế bào biểu mô ruột, chuyển GTP thành GDP. Trong tế bào, GDP tăng cao làm cho nồng độ ion Ca2+ cũng tăng cao, dẫn đến ngăn cản hấp thu chất điện giải và nƣớc ở trong xoang ruột. Do vậy, lƣợng nƣớc trong ruột tăng cao, kích thích niêm mạc ruột, tăng co bóp, làm gia súc ỉa chảy. Theo Đỗ Trung Cứ (2001)[8] 72,7% các chủng Salmonella phân lập đƣợc từ lợn sau cai sữa bị ốm, chết nghi phó thƣơng hàn sản sinh độc tố chịu nhiệt.
- Yếu tố thẩm xuất chậm của Salmonella có cấu trúc, thành phần giống độc tố không chịu nhiệt của vi khuẩn E. coli (Heat Labile Toxin: LT) và thực hiện chức năng thẩm xuất chậm từ 18- 24 giờ, có thể kéo dài 36- 48 giờ. Độc tố thẩm xuất chậm bị phá hủy ở 70oC trong vòng 30 phút và ở 56oC trong vòng 4 giờ. Cấu trúc phân tử gồm 3 chuỗi polypeptid và một số hợp chất khác. Phân tử lƣợng 40.000- 50.000 dalton. Độc tố thẩm xuất chậm của Salmonella làm thay đổi quá trình trao
đổi nƣớc và chất điện giải, dẫn đến tăng cƣờng bài xuất nƣớc và chất điện giải từ mơ bào vào lịng ruột, cản trở sự hấp thu, gây thối hóa lớp tế bào villi của thành ruột, gây tiêu chảy.
Đỗ Trung Cứ và cs (2003)[9] đã kết luận: 81,81% số chủng S.typhimurium
phân lập từ lợn mắc bệnh tiêu chảy sản sinh độc tố khơng chịu nhiệt có khả năng gây tích nƣớc trong ruột non của lợn thí nghiệm.
1.8.2.2. Nội độc tố (Endotoxin).
Nội độc tố nằm ở lớp màng ngoài của tế bào vi khuẩn và đƣợc cấu tạo bởi thành phần cơ bản là Lipopolysaccharid (LPS). LPS có cấu tạo phân tử lớn, gồm 3 vùng riêng biệt với các đặc tính và chức năng riêng biệt: Vùng ƣa nƣớc, vùng lõi và vùng lipit A. Vùng ƣa nƣớc bao gồm một chuỗi Polysaccharid chứa các đơn vị cấu trúc kháng nguyên O. Vùng lõi có bản chất là acid heterooligosaccharid, ở trung tâm, nối kháng nguyên O với vùng lipit A. Vùng lipit A đảm nhận chức năng nội
độc tố của vi khuẩn. Cấu trúc nội độc tố gần giống với cấu trúc của kháng nguyên O. Cấu trúc nội độc tố biến đổi sẽ dẫn đến sự thay đổi độc lực của Salmonella. Các đột biến gen ở vùng lõi, vùng ƣa nƣớc làm cho Salmonella khơng cịn độc lực (Trần Quang Diên, 2002 [26]).
Lipit A có ái lực với màng tế bào, với lipit khác và với Protein. Điều đó chứng tỏ lipit A chính là trung tâm hoạt động của nội độc tố. Vùng đa đƣờng Polysaccharid, chỉ giữ vai trò là vật mang các lipit khơng hịa tan. Nội độc tố là LPS đƣợc tiết ra từ vách tế bào vi khuẩn khi bị dung giải. Trƣớc khi thể hiện độc tính, LPS cần phải liên kết với các yếu tố liên kết tế bào hoặc các receptor bề mặt các tế bào nhƣ: Tế bào lâm bao cầu B, lâm bao cầu T, tế bào đại thực bào, tiểu cầu, tế bào gan lách. Rất nhiều các cơ quan trong cơ thể vật chủ chịu sự tác động của nội độc tố LPS: Gan, thận, cơ, hệ tim mạch, hệ tiêu hóa và hệ thống miễn dịch với các biểu hiện bệnh lý nhƣ: Tắc mạch máu, giảm trƣơng lực cơ, thiếu oxy mô bào, toan huyết, rối loạn tiêu hóa, mất tính thèm ăn.
1.8.2.3. Độc tố tế bào (Cytotoxin).
Đặc tính chung của Cytotoxin là có khả năng ức chế tổng hợp Protein của tế bào có nhân và làm trƣơng tế bào CHO (Chinese Hamster Ovary cell). Đa phần độc tố của chúng bị phá hủy bởi nhiệt độ. Theo Clarke và cs (1988) [38], làm tổn thƣơng tế bào biểu mơ là đặc tính quan trọng của Cytotoxin.
Có ít nhất là 3 dạng Cytotoxin:
- Dạng 1: Không bền vững với nhiệt và mẫn cảm với Trypsin. Độc tố này có trọng lƣợng phân tử khoảng 56- 78 kDa, nó tác động theo cơ chế là ức chế tổng hợp Protein của tế bào Hela và làm teo tế bào.
- Dạng 2: Có nguồn gốc từ Protein màng ngồi tế bào vi khuẩn, có cấu trúc và chức năng gần giống với các dạng độc tố tế bào do Shigella và các chủng Enterotoxigenic E. coli (ETEC) sản sinh ra. Dạng độc tố này cũng có ở hầu hết các serovar Salmonella gây bệnh.
- Dạng 3: Dạng này có liên quan với Hemolysin. Dạng độc tố này tác động lên tế bào theo cơ chế dung giải các khơng bào nội bào.Trong phịng thí nghiệm,
độc tố này gây chết tế bào Vero, tế bào Hela và tế bào CHO (Rahman và cs, 1992 [67]). Trên đây là 3 loại độc tố gây bệnh chính của vi khuẩn Salmonella, chúng là
các tác nhân trực tiếp, quyết định khả năng gây bệnh của vi khuẩn. Một số serotyp nhƣ:S.choleraesuis, S.typhimurium, S.enteritidis, S.dublin, S.gallinarum, S.pullorum có mang các plasmid có kích thƣớc lớn (khoảng từ 50- 100 kb). Chính những plasmid này có mang các yếu tố di truyền quyết định khả năng sản sinh các yếu tố độc lực gây bệnh cho ngƣời và gia súc với tỷ lệ ốm và chết cao (Krause và Fang, 1995[54]).
1.9. Một số nghiên cứu về tình trạng nhiễm vi khuẩn Salmonella trên
thực phẩm tại Việt Nam.
Theo Trần Thị Hạnh và cs (1999) [27] đã nghiên cứu về tình trạng nhiễm
Salmonella tại các cơ sở chăn nuôi gà công nghiệp, đã xác định vi khuẩn trong thức
ăn hỗn hợp, nƣớc uống, nƣớc thải, chất độn chuồng, vỏ trứng và lòng đỏ trứng. Tác giả đã nhận xét: Tỷ lệ nhiễm Salmonella cao nhất ở chất độn chuồng là 80%, thấp nhất là vỏ trứng và lòng đỏ trứng là 18,29%. Lê Minh Sơn (2003)[12] đã xác định đƣợc tỷ lệ nhiễm Salmonella trong thịt lợn giết mổ tiêu dùng nội địa trung bình là 10,91-16,67% và trong thịt lợn xuất khẩu trung bình là 1,42%. Tô Liên Thu (2005)[24] đã xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella là rất cao trong các mẫu thịt gà ở Hà Nội: 33% các mẫu lấy tại siêu thị, 40% các mẫu lấy từ chợ.
Năm 2005, Trần Thị Nhài [30] nghiên cứu về hiện trạng ô nhiễm vi khuẩn trong thịt tƣơi sống trên thị trƣờng Hà Nội và đã đề xuất một số giải pháp kỹ thuật. Tác giả cho thấy tỷ lệ nhiễm Salmonella trong các mẫu thịt lợn là: 39,5%, thịt gà là 43,02%. Đỗ Ngọc Thúy và cs (2006)[7] trong một nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm các loại vi khuẩn khác nhau trong thịt tƣơi tại các chợ tự do trên địa bàn Hà Nội đã xác định đƣợc tỷ lệ nhiễm Salmonella spp. trung bình trong thịt là 30% (trong đó có
47,1% ở thịt gà, 27,3% ở thịt lợn và 19% ở thịt bò).
Van và cs (2007)[79] trong một nghiên cứu với các mẫu thu thập đƣợc từ các chợ và siêu thị quanh khu vực thành phố Hồ Chí Minh (thời gian điều tra từ tháng 4-6/2004) đã xác định đƣợc tỷ lệ nhiễm Salmonella spp. trong thịt lợn 64%, thịt bò
62% và thịt gà 53,3%. Trong một điều tra về phân lập và nhận biết các chủng
Salmonella spp. từ các mẫu thu thập đƣợc ở các giai đoạn khác nhau trong toàn bộ