Quan sát hình thái

CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.4.2. Quan sát hình thái

a. Hình thái tế bào và khuẩn lạc vi khuẩn

 Quan sát hình dạng khuẩn lạc: Vi khuẩn được cấy ria trên môi trường canh thang, sau 2 ngày, quan sát hình thái bề mặt, màu sắc, kích thước…

 Quan sát hình thái tế bào: Vi khuẩn nuôi trong môi trường canh thang 24 giờ, quan sát tế bào.

 Nhuộm Gram

- Dung dịch tím kết tinh: 2g tím kết tinh hịa tan trong 20ml ethanol 95%; 0,8g ammoni oxalate hòa tan trong 80ml nước cất. Trộn hai dịch nói trên lại với nhau, giữ 48 giờ rồi lọc. Bảo quản trong lọ tối màu, sử dụng trong vài tháng.

- Dung dịch Lugol: hòa tan 2g KI trong 30ml nước cất, thêm 1g iodine, khuấy cho tan hết, thêm nước cất cho đủ 300ml. Bảo quản trong lọ tối màu.

- Dung dịch tẩy màu: ethanol 95% hoặc trộn hỗn hợp 70ml ethanol 95% với 30ml acetone.

- Dung dịch nhuộm bổ sung: chuẩn bị sẵn dung dịch Safranin O 2,5% trước khi dung pha với nước cất theo tỉ lệ 1:5 để có dung dịch 0,5%.

* Cách tiến hành

 Chuẩn bị vết bơi: dùng que cấy vơ trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào một giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khơ trong khơng khí.  Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2 - 3 lần.

 Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.  Nhuộm lại bằng dung dịch Lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.

 Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô.

 Nhuộm bổ sung bằng dung dịch safranin trong 2 – 3 phút, rửa nước, để khơ trong khơng khí.

b. Quan sát hình thái xạ khuẩn

- Quan sát hình dạng khuẩn lạc: Xạ khuẩn được cấy ria trên môi trường thạch YG, sau 2 - 5 ngày lấy ra quan sát hình thái bề mặt, màu sắc, kích thước khuẩn lạc. - Quan sát hình dạng cuống sinh bào tử: xạ khuẩn được nuôi trên môi trường YG, cắm lamen nghiêng. Sau 2-5 ngày lấy lamen quan sát hình dạng cuống sinh bào tử và đếm số lượng bào tử trên kính hiển vi quang học.

2.2.5 Nghiên cứu điều kiện ni cấy thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase ở các chủng vi sinh vật nghiên cứu

2.2.5.1. Nghiên cứu điều kiện ni cấy giống thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase ở các chủng nghiên cứu

a. Mơi trường thích hợp

Vi khuẩn được ni cấy lắc 200 vịng/phút, 40oC trong 5 mơi trường dịch thể kí hiệu là: V1, V2, V3, V4, V5. Sau 2 ngày thu dịch và xác định hoạt tính enzyme và khả năng sinh trưởng.

Xạ khuẩn được ni cấy lắc 200 vịng/phút, 40oC trong 5 môi trường dịch thể ký hiệu là: X1, X2, X3, X4, X5. Dịch nuôi cấy sau 2 ngày được xác định hoạt tính enzyme và khả năng sinh trưởng.

b. Nhiệt độ thích hợp

Các chủng nghiên cứu được ni cấy trong mơi trường thích hợp ở nhiệt độ 25, 30, 35, 40, 50 và 55oC trên máy lắc ổn nhiệt. Sau 2 ngày, thu dịch, xác định hoạt tính xylanase và khả năng sinh trưởng.

c. pH thích hợp

Các chủng nghiên cứu được nuôi cấy lắc 200 vịng/phút trên mơi trường thích hợp, pH được chỉnh ở các giá trị: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9. Sau 2 ngày, thu dịch, xác định hoạt tính xylanase và khả năng sinh trưởng.

d. Thời gian thích hợp cho giống khởi động

Chủng vi khuẩn được nuôi cấy lắc trong môi trường canh thang ở nhiệt độ thích hợp. Thu dịch ni cấy sau 8, 16, 24, 32, 40 giờ và xác định mật độ tế bào ở OD 600.

Chủng xạ khuẩn được nuôi cấy lắc trong môi trường YG ở nhiệt độ thích hợp. Thu dịch ni cấy sau 24, 30, 36, 42, 48 giờ, lọc qua giấy lọc và xác định sinh khối.

a. Lựa chọn cơ chất

Các chủng vi sinh vật được nuôi trên các cơ chất xốp khác nhau, ủ 3 ngày ở 40oC, sau đó được chiết bằng nước theo tỷ lê ̣ 1 cơ chất: 3 nước, lắc 200 vòng/phút trong 3 giờ. Chiết dịch enzyme bằng ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút và xác định hoạt độ enzyme.

b. Lựa chọn thời gian nuôi cấy

Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn được nuôi cấy xốp trên cơ chất thích hợp, ở 400C với thời gian từ 1 - 7 ngày. Chiết dịch, xác định hoạt độ xylanase.

c. Lựa chọn độ ẩm

Các chủng vi sinh vật được nuôi trên các cơ chất xốp thích hợp ở các độ ẩm lần lượt là 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80%. Ủ trong 3 ngày ở 40oC, chiết bằng nước và xác định hoạt độ xylanase.

d. Lựa chọn tỷ lệ giống cấy

Các chủng vi sinh vật được cấy vào các cơ chất xốp thích hợp với các tỷ lệ 5, 10, 15, 20 và 25%. Ủ 3 ngày, thu dịch và xác định hoạt độ xylanase.

e. Lựa chọn nguồn cacbon bổ sung

Các chủng vi sinh vật được ni cấy trên cơ chất xốp có bổ sung thêm 4% nguồn carbon là glucose, sacarose, D-lactose, D-Mannitol, xylose trên. Sau 3 ngày, chiết bằng nước, thu dịch và xác định hoạt độ xylanase.

f. Lựa chọn nguồn nitơ bổ sung

Các chủng vi sinh vật được ni cấy trên cơ chất xốp thích hợp, có bổ sung 4% nguồn nitơ là (NH4)2SO4, nitrat, nitrit, cao malt, cao thịt, cao men, peptone, ure. Sau 3 ngày, chiết bằng nước, thu dịch và xác định hoạt độ xylanase.

g. Lựa chọn nguồn khoáng

Các chủng vi sinh vật được nuôi trên cơ chất xốp làm ẩm bằng các hỗn hợp khoáng khác nhau. Sau 3 ngày, chiết bằng nước, thu dịch và xác định hoạt độ xylanase.

Thành phần các loại khoáng như sau [10]:

MA1 (g/l): MgSO4.7H2O- 0.5; K2HPO4- 1.5; pH 8.0;

MA2 (g/l): MgSO4 .7H2O- 0.5; K2HPO4- 1.5; peptone 2.0; yeast extract 2.0; pH 8.0;

MA3 (g/l): MgSO4.7H2O- 0.1; Na2HPO4- 11.0; NaH2PO4- 6.0; KCl 3.0; pH 8.0; Và MA4 g/l): MgSO4.7H2O- 0.5; K2HPO4 - 0.1; (NH4)2H2PO4 - 1.0; CaCl2 - 0.1; FeSO4- 0.1; MnSO4- 0.1; pH 8.0.

2.2.6. Thu hồi enzyme

2.2.6.1. Chiết enzyme

Sau 3 ngày nuôi cấy xốp các chủng vi sinh vật trên các cơ chất thích hợp- tiến hành chiết enzyme sử dụng các loại dung dịch chiết khác nhau: các loại đệm- nước và nước dung dịch NaCl 0.9%. Các loại đệm được dùng là: citrate- phosphat và Tris-HCl- ở nồng độ 0.5M- pH7. Tỷ lệ cơ chất: dịch chiết là 1:3.

2.2.6.2. Thu hồi enzyme bằng các dung môi hữu cơ

Nuôi các chủng vi sinh vật trên các môi trường dịch thể và xốp thích hợp, sau 2 ngày/dịch và 3 ngày/xốp, chiết dịch enzyme. Tủa enzyme bằng các dung môi hữu cơ (các dung môi hữu cơ được sử dụng là cồn 100% và aceton lạnh):

- Đổ từ từ một lượng dịch enzyme vào bình đựng cồn 100% hoặc axeton lạnh đang được đặt trên máy khuấy từ ở 4oC theo tỷ lệ thể tích 1 : 3. Tiếp tục khuấy trong 30 phút để trộn đều hỗn hợp.

- Hỗn hợp trên được đặt vào tủ lạnh ở nhiệt độ - 20oC để qua đêm. - Ly tâm lạnh ở 4oC- 9000g / phút trong 10 phút và thu cặn.

- Bổ sung nước cất vào cặn. Lắc nhẹ bằng máy lắc để từ từ hòa tan cặn. Dịch đã hịa tan được dùng làm dịch enzyme cho các thí nghiệm tiếp theo.

2.2.6.3. Thu hồi enzyme bằng muối ammonisunfat

Nuôi các chủng vi sinh vật trên các môi trường dịch thể và xốp thích hợp, sau 2 ngày/dịch và 3 ngày/xốp, chiết dịch enzyme. Tủa enzyme bằng muối ammonisunfat bão hòa 80%.

Cách tiến hành

- 20 ml dịch nuôi cấy enzyme đựng trong ống Falcon 50 đặt trên máy khuấy từ. Muối ammonisunfat được thêm vào ở các nồng độ từ 30 đến 90% với khối lượng như sau:

Phân đoạn (1): 0 -> 30%: 3.28 g ammonisunfat. Phân đoạn (2): 30 -> 40%: 1 12 g ammonisunfat. Phân đoạn (3): 40 -> 50%: 1.16 g ammonisunfat. Phân đoạn (4): 50 -> 60%: 1-2 g ammonisunfat. Phân đoạn (5): 60 -> 70%: 1.24 g ammonisunfat. Phân đoạn (6): 70 -> 80%: 1.3 g ammonisunfat. Phân đoạn (7): 80 -> 90%: 1.34 g ammonisunfat.

ở 4oC. Chuyển dịch trong sau ly tâm sang một ống falcon khác- sau đó tiếp tục bổ sung ammonisunfat vào dịch này đến các nồng độ tiếp theo. Cặn sau ly tâm được hoàn nguyên về nồng độ ban đầu bằng nước cất. Dịch thu được sau khi hịa tan hồn tồn cặn được dùng để xác định hoạt độ xylanase.

2.2.7. Tinh sạch xylanase của chủng 118

2.2.7.1. Tủa enzyme trong dung môi hữu cơ

Chủng 118 được nuôi trên môi trường dịch thể X2- sau 2 ngày- thu dịch và tủa enzyme bằng các dung môi hữu cơ (cồn 100% và aceton lạnh) theo phương pháp đã nêu ở mục 2.2.6.2.

2.2.7.2. Tủa enzyme trong muối ammonisunfat

Chủng 118 được nuôi trên các môi trường dịch thể X2- sau 2 ngày- thu dịch và tủa enzyme bằng ammonisunfat bão hòa 30 đến 90%.

Cách tiến hành

Ở mỗi phân đoạn, dịch enzyme đã hòa tan ammonisunfat được ủ trong đá 30 phút sau khi đã hịa tan hồn tồn ammonisunfat. Ly tâm hỗn hợp ở 9500 g/10phút ở 4oC. Chuyển dịch trong sau ly tâm sang một ống falcon khác- sau đó tiếp tục bổ sung ammonisunfat vào dịch này đến các nồng độ tiếp theo. Cặn sau ly tâm được bổ sung 200 µl nước cất (dịch enzyme được cô đặc 100 lần). Dịch thu được sau khi hịa tan hồn tồn cặn được dùng để xác định hoạt tính xylanase. Một phần dịch này được dùng làm mẫu để chạy điện di SDS-PAGE.

2.2.7.3. Sắc ký trao đổi ion

Dịch enzyme sau khi tủa trong dung môi hữu cơ được tra lên cột sắc ký trao đổi ion sepharose DEAE với tổng thể tích 15 ml. Cột sắc ký có kích thước 16 x 200 mm được cân bằng với 20mM Tris- HCl, pH 8.0. Sau khi rửa cột bằng đệm 20mM

Tris- HCl, pH 8.0, enzyme xylanase được đẩy ra bằng gradient NaCl (từ 0 đến 1000 mM). Tốc độ dòng đi qua cột là 3 ml/phút. Thu 20 phân đoạn. Thể tích mỗi phân đoạn là 5 ml. Xác định hoạt độ xylanase và nồng độ protein ở mỗi phân đoạn. Ở các phân đoạn có hoạt độ xylanase cao thì được giữ lại và tiếp tục được tra lại lên cột sắc ký trao đổi ion DEAE để thu xylanase.

2.2.8. Điện di

2.2.8.1. Điện di trên gel SDS-PAGE

Độ tinh sạch và trọng lượng phân tử của enzyme được kiểm định bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide có chứa SDS (SDS-PAGE) của Laemmli (1970). Thành phần bản gel điện di như sau:

- Gel co 12%Tc (resolving gel): gồm 3.35 ml H2O; 2.5 ml Tris-Cl 1.5M- pH 8.8; 0.1 ml SDS 10%; 4.0 ml Acrylamide/bis (30% T- 2.7% C); Ammonium persunfat 10% 50 µl (0.05%); 5µL TEMED (0.05%).

- Gel tách (stacking gel): 6.1 ml H2O; 2.5 ml Tris-Cl 0.5 M- pH 6.8; 1.5 ml dung dịch stock acrylamide (30% T); 0.1 ml SDS 10%; 50 µl APS 10%; 10 µl TEMED.

Sau khi đổ lớp gel phân tách thì cho ngay một lớp nước lên trên chờ 30 phút để gel phân tách đông. Loại bỏ lớp nước và đổ tiếp lớp gel co- gắn lược- chờ 30 phút để gel đông. Đặt bản gel vào buồng điện di và nạp mẫu. Mẫu enzyme được trộn đều với đệm khử SDS (950µl đệm mẫu : 50µl 2-mercaptoethanol) với tỷ lệ 1V enzyme : 3V đệm mẫu. Đun 95oC 4 phút. Mẫu được tra vào giếng và để ổn định trong 5 phút trước khi chạy. Điều chỉnh hiệu điện thế chạy 90V trong khoảng 2.5 đến 3h.

Kết thúc chạy gel tiến hành nhuộm như sau: nhuộm gel trong bể nhuộm với 100 ml dung dịch Coomassie Brilliant Blue R-250 trong 1h có lắc nhẹ để các protein bắt màu đồng đều. Sau đó, bản gel được ngâm trong dung dịch tẩy trong 30 phút- lắc nhẹ để loại bỏ hết dịch nhuộm cho đến khi băng protein hiện rõ.

2.2.8.2. Điện di trên gel hoạt tính

Để kiểm tra hoạt tính của các mẫu enzyme thu được sau khi tủa bằng dung môi hữu cơ, tủa bằng muối ammonisunfat và các phân đoạn có hoạt tính xylanase cao trong sắc ký trao đổi ion, chúng tơi tiến hành điện di trên gel hoạt tính.

Thành phần bản gel điện di giống thành phần bản gel trong điện di SDS- PAGE tuy nhiên, thay nước bằng dung dịch xylan (0.06g xylan trong 20 ml H2O).

Bản điện di được chạy dưới hiệu điện thế 90V trong khoảng 2 đến 3h. Sau đó, bản gel được hồi tính bằng Triton 2.5% trong 1h, ngâm trong đệm 50 mM Tris-

HCl, pH 7.0 trong 15 phút đặt trong bể ổn nhiệt ở 50oC. Tiếp theo, bản gel được ngâm trong Côngô đỏ 30 phút và ngâm trong dung dịch 1000 mM NaCl 30 phút. Đọc kết quả điện di.

2.2.9. Nghiên cứu đặc tính enzyme

2.2.9.1. pH thích hợp cho hoạt động của enzyme

Cơ chất (xylan 1%) được hòa tan vào các đệm được chỉnh ở các giá trị pH khác nhau, dải pH dao động từ 2-9. Sau đó tiến hành xác định hoạt tính xylanase bằng phương pháp định lượng.

2.2.9.2.Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme

Hỗn hợp phản ứng (enzyme + cơ chất) được ủ ở các nhiệt độ khác nhau từ 35, 40, 45, 50, 55oC sau đó xác định hoạt tính xylanase bằng phương pháp định lượng.

2.2.9.3. Khả năng bền nhiệt của enzyme

Dịch enzyme được đặt ở các nhiệt độ từ 60, 70, 80, 90, 100oC trong bể ổn nhiệt trong thời gian 10 phút. Sau đó- xác định hoạt tính xylanase bằng phương pháp định lượng.

2.2.9.4. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt độ enzyme

Nhỏ 50µl dịch enzyme vào các ống nghiệm. Thêm tiếp 10 µl dung dịch ion kim loại nồng độ 100 mM. Thêm 150µl cơ chất xylan 1% vào hỗn hợp phản ứng. Nồng độ ion kim loại trong hỗn hợp phản ứng 5mM. Sau đó đặt ống phản ứng vào bể ổn nhiệt ở 50oC, trong 10 phút. Xác định hoạt tính xylanase bằng phương pháp định lượng.

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN 3.1. KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN

3.1.1. Lựa chọn các chủng có hoạt độ xylanase cao

26 chủng được nuôi trên môi trường dịch thể. Sau 2 ngày thu dịch, xác định hoạt độ xylanase bằng phương pháp định lượng và định tính. Sau đó, chọn ra các chủng có hoạt độ xylanase cao.

Bảng 3.1. Hoạt tính xylanase của 26 chủng vi sinh vật nghiên cứu

Chủng Hoạt tính xylanase Chủng Hoạt tính xylanase

VPG (D-d) mm U/ml VPG (D-d) mm U/ml 16 27 115 442 25 93 20 12 13 444 27 102 36 20 13 458 21 54 76 21 71 523 23 25 118 28 184 525 19 45 153 17 12 598 26 67 226 19 47 E1 19 16 425 11 14 E2 24 98 426 22 57 I76 28 105 428 25 8 472 28 62 434 26 76 477 24 65 437 24 59 15.2 27 58 438 28 69 B2H2 29 171

Theo kết quả trong bảng trên, từ 26 chủng vi sinh vật ban đầu , chúng tôi đã chọn ra được 7 chủng có khả năng sinh xylanase mạnh, trong đó, 2 chủng vi khuẩn là: 16, B2H 2 và 5 chủng xạ khuẩn là: 118, 442, 444, E2, và I76. Dịch enzyme của 7 chủng này được dùng để xác định khả năng bền nhiệt.

3.1.2. Lựa chọn các chủng vi sinh vật bền nhiệt có hoạt tính xylanase cao

Từ 2 chủng vi khuẩn và 5 chủng xạ khuẩn có hoạt độ xylanase cao đã chọn, nuôi trên môi trường dịch thể, thu dịch enzyme, xử lý ở 60oC trong các khoảng thời gian 10 phút, 20 phút, 30 phút. Sau đó, tiến hành xác định hoạt tính xylanase bằng phương pháp định tính và định lượng, thu được kết quả như sau:

Bảng 3.2. Khả năng chịu nhiệt của các chủng vi sinh vật

STT Chủng Nhiệt độ (0C) Thời gian xử lý (phút) Hoạt tính xylanase

Vi sinh vật sinh xylanase

Lựa chọn độ ẩm thích hợp