CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.6. Khuếch đại toàn bộ hệ gen
Các mẫu phôi bào sau khi được sinh thiết từ phơi ngày 5, trải qua q trình rửa phơi sẽ được thực hiện bước khuếch đại toàn bộ hệ gen sử dụng bộ kit SurePlex DNA Amplification System của hãng Illumina. Đối với mỗi qui trình rửa phơi, sẽ lấy kèm tối thiểu 1 ống thể tích 2,5 µl dung dịch môi trường của giọt rửa cuối cùng trong quá trình rửa phơi, kí hiệu CC. Qui trình khuếch đại gồm các bước sau:
Chuẩn bị 1 mẫu chứng âm với thể tích 2,5 µl dung dịch Phosphate-buffered saline (PBS) 1X cho vào ống PCR 0.2 ml kí hiệu Neg; 1 mẫu chứng dương với thể tích 2,5 µl mẫu chuẩn female genomic DNA nồng độ 25 pg/µl kí hiệu POS. Tiến hành ly tâm các ống chứa phôi bào ở 200 g trong 3 phút ở nhiệt độ 4oC, rồi bổ sung 2,5 µl cell extraction buffer vào các ống chứa mẫu phôi bào và các ống mẫu chứng. Chuẩn bị Extraction cocktail theo bảng 5, rồi thêm 5 µl Extraction cocktail vào các ống chứa mẫu và control, sau đó ly tâm nhanh rồi đưa vào ủ theo chu trình nhiệt trong máy PCR ở 75oC trong vòng 10 phút và 95oC trong vòng 4 phút, giữ ở nhiệt độ phịng sau khi hồn thành.
Bảng 5 Thành phần phản ứng ly giải
tế bào Bảng 6 khuếch đại toàn bộ hệ gen Thành phần phản ứng tiền
Extraction
cocktail Màu nắp Thể tích 1 mẫu Extraction enzyme dilution buffer Nắp tím 4,8 µl Cell extraction enzyme Nắp vàng 0,2 µl Tổng thể tích 5 µl Pre-am
Cocktail Màu nắp Thể tích 1 mẫu SurePlex Pre-
amp buffer Màu đỏ 4,8 µl SurePlex Pre-
amp enzyme
Màu
trắng 0,2 µl Tổng thể tích 5 µl
Bảng 7 Thành phần phản ứng khuếch đại toàn bộ hệ gen
Amplification cocktail Màu nắp Thể tích 1 mẫu SurePlex amplification buffer Màu da cam 25 µl SurePlex amplification
enzyme Màu xanh da trời 0,8 µl
Nuclease-free water Nắp không màu 34,2 µl
Tổng thể tích 60 µl
Các ống mẫu sau khi hồn thành chu trình nhiệt trong máy PCR được lấy ra, ly tâm nhanh và đặt lên các giá lạnh và chuẩn bị các bước tiếp theo.
Chuẩn bị Pre-amp cocktail theo bảng 6 sau đó bổ sung 5 µl Pre-amp Cocktail vừa chuẩn bị vào các ống chứa 10 µl mẫu đã chuẩn bị ở bước ly giải tế bào và ly tâm nhanh. Chuyển các ống mẫu vào máy PCR để thực hiện chu trình nhiệt 95oC trong vịng 2 phút; 12 chu kì 95 oC trong 15 giây, 15 oC trong 50 giây, 25 oC trong 40 giây, 35 oC trong 30 giây, 65 oC trong 40 giây và 75 oC trong 40 giây. Sau đó giữ ở 4 oC trong máy PCR.
Sản phẩm PCR được giữ trên khay lạnh trong lúc chuẩn bị Chuẩn bị Amplification cocktail (theo bảng 7). Cho 60 µl Amplification vừa chuẩn bị ở bước trên vào 15 µl sản phẩm của bước phản ứng tiền PCR. Đậy nắp và đảo ngược vài lần
để trộn đều sau đó ly tâm nhanh. Ủ các ống mẫu theo chu trình nhiệt sau: 95 oC trong 2 phút; 14 chu kì 95 oC trong 15 giây, 65 oC trong 1 phút và 75 oC trong 1 phút.
Sản phẩm của phản ứng PCR được bảo quản trên đá lạnh và sử dụng ngay trong qui trình chuẩn bị thư viện hoặc bảo quản ở nhiệt độ từ -25oC đến -15oC trong 1 tháng.
Kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR này bằng cách điện di 5 µl sản phẩm PCR trên gel agarose 1 - 1.5% /TBE 1X.