Xuất xứ
Chỉ tiêu theo dõi về hình thái
Thân Lá Hoa Quả
Tùng Vài Thân màu lục, thân hình trụ Lá mặt trên xanh thẫm, mặt dưới xanh nhạt, mép lá có răng cưa, phiến lá hình bầu dục
Thời điểm quan sát cây chưa có hoa
Thời điểm quan sát cây
37 Cao Mã Pờ Thân phân nhánh, nhỏ màu xanh Lá mặt trên xanh thẫm, mặt dưới xanh nhạt, mép lá có răng cưa, phiến lá hình bầu dục
Thời điểm quan sát cây chưa có hoa
Thời điểm quan sát cây chưa có quả Thái An Thân phân nhánh, nhỏ màu xanh Lá mặt trên xanh thẫm, mặt dưới xanh nhạt, mép lá có răng cưa, phiến lá hình bầu dục Bơng kép, ít nhánh, nhánh ngắn với hoa nhỏ màu
trắng khơng có cuống và có một nhị Quả nhỏ, chưa chín có màu xanh, quả chín có màu đỏ gạch.
a) Tùng Vài b) Cao Mã Pờ c) Thái An
Hình 3.3. Mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Quản Bạ 3.2.4. Đặc điểm mẫu cây Sói rừng thu thập được tại huyện Hồng Su Phì 3.2.4. Đặc điểm mẫu cây Sói rừng thu thập được tại huyện Hồng Su Phì
Cây Sói rừng có chiều cao khoảng 34 cm, thân nhẵn, các mấu hơi phồng. Nhánh cây trịn, khơng có lơng, với các lá mọc đối, phiến dài hình bầu dục hay hình ngọn giáo, chiều dài 7–12 cm và rộng 2–6 cm với 5-7 cặp gân bên. Mép lá có răng cưa nhọn và thô, kèm với các tuyến. Cuống lá dài 5–8 mm.
Bảng 3.6. Đặc điểm hình thái các mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Hồng Su Phì
Xuất xứ
Chỉ tiêu theo dõi về hình thái
Thân Lá Hoa Quả
Hồ Thầu Thân màu lục, thân hình trụ Lá mặt trên xanh thẫm, mặt dưới xanh nhạt, mép lá có răng cưa, Thời điểm quan sát cây chưa có hoa Thời điểm quan sát cây chưa có quả
38 phiến lá hình bầu dục Nậm Ty Thân phân nhánh, nhỏ màu xanh Lá mặt trên xanh thẫm, mặt dưới xanh nhạt, mép lá có răng cưa, phiến lá hình bầu dục Thời điểm quan sát cây chưa có hoa Thời điểm quan sát cây chưa có quả Bản Péo Thân phân nhánh, nhỏ màu xanh Lá mặt trên xanh thẫm, mặt dưới xanh nhạt, mép lá có răng cưa, phiến lá hình bầu dục Thời điểm quan sát cây chưa có hoa Thời điểm quan sát cây chưa có quả a) Hồ Thầu b) Nậm Ty c) Bản Péo
Hình 3.4. Mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Hồng Su Phì 3.2.5. Đặc điểm mẫu cây Sói rừng thu thập được tại huyện Vị Xuyên 3.2.5. Đặc điểm mẫu cây Sói rừng thu thập được tại huyện Vị Xuyên
Cây Sói Rừng thu thập tại Huyện Vị Xuyên là loài cây nhỏ, cao trung bình khoảng 1,2 m; đốt phồng to, nhánh trịn, khơng lơng, mọc đối. Lá mọc đối, có phiến dài hình bầu dục, dài 7- 13cm, rộng 2 – 4 cm, đầu nhọn, mép có răng nhọn, gân phụ 5 cặp; cuống ngắn 5-10mm.
Bảng 3.7. Đặc điểm hình thái các mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Vị Xuyên
Xuất xứ
Chỉ tiêu theo dõi về hình thái
Thân Lá Hoa Quả
Thượng Sơn
Thân màu lục, thân hình trụ
Lá mặt trên xanh thẫm, mặt dưới xanh nhạt, mép lá có răng
Thời điểm quan sát cây chưa có hoa
Thời điểm quan sát cây
39
cưa, phiến lá hình bầu dục chưa có quả
Cao Bồ
Thân phân nhánh nhỏ, màu xanh lục
Lá mặt trên xanh thẫm, mặt dưới xanh nhạt, mép lá có răng
cưa, phiến lá hình bầu dục
Thời điểm quan sát cây chưa có hoa
Thời điểm quan sát cây chưa có quả Thị trấn Vị Xuyên Thân phân nhánh nhỏ, màu xanh Lá mặt trên xanh thẫm, mặt dưới xanh nhạt, mép lá có răng
cưa, phiến lá hình bầu dục
Bơng kép, ít nhánh, nhánh ngắn với hoa nhỏ màu trắng khơng có cuống
và có một nhị
Thời điểm quan sát cây chưa có quả
a) Thượng Sơn b) Cao Bồ c) Thị trấn Vị Xun
Hình 3.5. Mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Vị Xuyên
Theo Dược điển Việt Nam V, lồi Sói rừng được mơ tả như sau:
Đoạn thân hình trụ thường phân nhánh, màu lục, dài 10 cm đến 15 cm, đường kính 0,3 cm đến 1,3 cm, mang lá mọc đối; phiến lá hình bầu dục, dài 7 cm đến 18 cm, rộng 2 c đến 7 cm, mép lá có răng cưa nhọn, cuống lá ngắn 0,5 cm đến 0,8 cm, lá có màu lục nhạt. Mùi thơm nhẹ, vị hơi hăng. Dược liệu sau khi cắt đoạn phơi khô là các đoạn thân lá dài từ 3 cm đến 5 cm, bên ngồi có màu xanh lục tối hoặc nâu tối có các nếp nhăn dọc hiện rõ, rải rác có các nốt sần nhơ lên. Mặt cắt thân có tủy hoặc lỗ rỗng ở giữa [32].
Mặt cắt ngang tiết diện hơi tròn. Quan sát dưới kính hiển vi thấy: Bần cấu tạo bởi nhiều lớp tế bào hình chữ nhật bị ép dẹt thành hàng đồng tâm và dãy xuyên tâm. Mô mềm vỏ cấu tạo bởi các tế bào hình đa giác hay hình trứng thành mỏng, xếp không đều. Sau mơ mềm là sợi xếp thành vịng trịn. Phần libe-gỗ: Bó chồng mạch
40
hở rất phát triển xếp thành vịng trịn sít nhau. Trong cùng là mơ mềm ruột cấu tạo bởi các tế bào hình trịn hay hình đa giác, thành mỏng, có kích thước lớn. Rải rác trong mỏ mềm vỏ và ruột có các tế bào cứng [32].
Gân lá: Gân phía trên hơi lồi, phía dưới lồi nhiều. Biểu bì trên và dưới) là một hàng tế bào hình chữ nhật nhỏ xếp đều đặn, phía ngồi phủ một lớp cutin mỏng. Hạ bì gồm một lớp tế bào hình gần trịn nhỏ xếp đều đặn. Mơ mềm cấu tạo bởi các tế bào thành mỏng hình đa giác hay hình trứng, kích thước khơng đều. Rải rác trong mơ mềm có các đám tế bào cứng. Giữa gân lá có hai bó libe-gỗ lớn nằm đối xứng nhau qua trục giữa của gân lá. mỗi bó có một cung mơ cứng gồm các tế bào có thành dày hố gỗ, phía trên là cung mạch gỗ, ở giữa là libe [32].
Phiến lá: Biểu bì trên và dưới là một hàng tế bào hình chữ nhật tương tự phần gân lá nhưng có kích thước nhỏ hơn. Lớp tế bào mô dậu quan sát không rõ. Mơ mềm gồm những tế bào có kích thước lớn, thành mỏng [32].
Bơng kép, ít nhánh, nhánh ngắn với hoa nhỏ màu trắng khơng có cuống và có một nhị. Bầu nhụy có hình trứng và khơng có vịi [32].
Qủa của cây Sói rừng nhỏ, khi chín có màu đỏ gạch, vỏ nhẵn mọng, quả gần trịn đường kính khoảng 4mm [32].
Như vậy theo đánh giá sơ bộ ban đầu về đặc điểm hình thái lá, thân, hoa và quả của mẫu thu thập thuộc 5 huyện Xín Mần, Mèo Vạc, Quản Bạ, Hồng Su Phì và Vị Xuyên của tỉnh Hà Giang cho kết quả các mẫu thu thập là cây Sói rừng.
3.3. Kết quả nhận dạng mẫu nguồn gen cây Sói rừng bằng chị thị DNA
3.3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số của mẫu Sói rừng nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu là 15 mẫu lá của cây Sói rừng được thu thập tại 15 xã của 05 huyện thuộc Tỉnh Hà Giang (bảng 3.8).
Bảng 3.8. Danh sách 15 mẫu lá Sói rừng trong nghiên cứu
STT Huyện Xã, TT Kí hiệu 1 Xín Mần Nấm Dẩn SR1 2 Thu Tà SR2 3 Nà Chì SR3 4 Mèo Vạc Tả Lủng SR4 5 Lủng Chinh SR5
41 STT Huyện Xã, TT Kí hiệu 6 Nậm Ban SR6 7 Quản Bạ Tùng Vài SR7 8 Cao Mã Pờ SR8 9 Thái An SR9 10 Bắc Quang Tân Thành SR10 11 Thượng Bình SR11 12 Đức Xuân SR12 13 Vị xuyên Thượng Sơn SR13 14 Cao Bồ SR14 15 TT Vị Xuyên SR15
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp sử dụng CTAB của P. Doyle and Doyle (1987) có một số cải tiến nhỏ để tiến hành tách chiết ADN các mẫu Sói rừng nghiên cứu kết quả được thể hiện trong hình 3.6.
Hình 3.6. kết quả tách chiết DNA tổng số của 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu
ADN của 15 mẫu lá của cây Sói rừng được thu thập từ 15 xã của 05 huyện thuộc tỉnh Hà Giang sau khi tách chiết đều cho nồng độ và độ tinh sạch cao, các băng gọn sắc nét đảm bảo cho các bước thí nghiệm tiếp theo.
3.3.2. Kết quả PCR của mẫu Sói rừng nghiên cứu
Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi ITS4/ITS5 kết quả thu được cho thấy các mẫu lá thuộc 15 mẫu Sói rừng đều cho băng đơn hình với kích thước khoảng 730 bp (hình 3.7). Kết quả đảm bảo để thực hiên bước nghiên cứu giải trình tự tiếp theo.
42
Hình 3.7. Kết quả PCR của 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu với cặp mồi ITS4/ITS5; M: Marker generuler 1kb plus DNA 3.3.3. Kết quả giải trình tự vùng ITS-rDNA của mẫu Sói rừng nghiên cứu
Sản phẩm PCR với cặp mồi ITS4/ITS5 sau khi tinh sạch được phân tích trực
tiếp trên máy giải trình tự ABI PRISM 3700 DNA Analyzer (Applied Biotech) của cơng ty Macrogen (Hàn Quốc) Trình tự của 15 mẫu Sói rừng trong nghiên cứu được so sánh với trình tự gen tham chiếu đã được công bố mã số trên NCBI thông qua phần mềm MEGA v6.06.
Số liệu thu được trong bảng 3.4 của các mẫu Sói rừng có độ dài nucleotit là phù hợp với kết quả kiểm tra kích thước băng PCR ở hình 3.7. Kết quả ở bảng 3.4 cũng cho thấy, do có sự mất đoạn (InDel) hay thêm đoạn (InSert) ở một số vị trí trên đoạn gen nên số lượng nucleotit tổng số của mỗi đoạn trình tự có sự dao động giữa các mẫu nghiên cứu. Độ dài nucleotit của các mẫu dao động từ 709nu (SR10) đến 734nu (SR7, SR8, SR9 và SR14). Các mẫu SR5, SR13 có độ dài nucleotit là 733nu; mẫu SR15 có độ dài nucleotit là 732nu; các mẫu SR1, SR4 và SR6 có độ dài nucleotit là 731nu; các mẫu SR2, SR3 có độ dài nucleotit là 730nu; mẫu SR11 có độ dài nucleotit là 727nu; mẫu SR12 có độ dài nucleotit là 716nu (Phụ lục 1).
Bảng 3.9. Độ dài trình tự của 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu STT Kí hiệu Tổng số Nucleotide STT Kí hiệu Tổng số STT Kí hiệu Tổng số Nucleotide STT Kí hiệu Tổng số
Nucleotide
1 SR1 731 9 SR9 734
2 SR2 730 10 SR10 709
3 SR3 730 11 SR11 727
43
5 SR5 733 13 SR13 733
6 SR6 731 14 SR14 734
7 SR7 734 15 SR15 732
8 SR8 734
3.3.4. Kết quả phân tích đa dạng di truyền, xác định mối quan hệ di truyền giữa 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu mẫu Sói rừng nghiên cứu
Số liệu thu được ở bảng 3.10 cho thấy có sự tương đồng khá cao giữa 15 trình tự của 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu. Hệ số tương đồng về trình tự nucleotide cao nhất là 99,86% (giữa cặp mẫu SR1 - SR3 và SR13 - SR14). Hệ số tương đồng về trình tự nucleotide thấp nhất là 62,60% (giữa cặp mẫu SR1 - SR10 và SR6 - SR10). Kết quả so sánh sự tương đồng di truyền giữa 2 mẫu tham chiếu MH270480.1 Chloranthus erectus và KP317601.1 Sarcandra glabra với 15 mẫu nghiên cứu cho thấy: 15 mẫu Sói rừng có hệ số tương đồng về trình tự nucleotide với mẫu tham chiếu Chloranthus erectus dao động từ 59,21% (mẫu SR11 và Chloranthus erectus) đến 90,82% (mẫu SR2, SR3 và Chloranthus erectus). 15 mẫu Sói rừng có hệ số tương đồng về trình tự nucleotide với mẫu tham chiếu Sarcandra glabra dao động từ 66,17% (mẫu SR10 và Sarcandra glabra) đến 99,46% (mẫu SR8; SR9 và Sarcandra glabra).
44
Bảng 3.10: Hệ số tương đồng di truyền giữa 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu và 2 mẫu tham chiếu
Hình 3.8. Cây phát sinh chủng loại của 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu với mẫu tham chiếu MH270480.1 Chloranthus erectus và KP317601.1 Sarcandra glabra
Cây phát sinh loài được xây dựng dựa vào phần mềm Mega 6.0 theo phương pháp Maximum likelihood, kết quả từ 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu được phân làm 3 nhóm chính:
Nhóm thứ I: bao gồm 3 mẫu Sói rừng là SR10, SR11 và SR12) có hệ số tương
đồng về trình tự nucleotide dao động từ 95,64% (SR11 và SR12) đến 98,04% (SR10 và SR12). Hệ số tương đồng về trình tự nucleotide giữa các mẫu nghiên cứu trong nhóm này với mẫu tham chiếu Sarcandra glabra (dao động từ 66,17% đến 68,99%) cao
45
hơn mẫu tham chiếu Chloranthus erectus (dao động từ 59,21% đến 60,28%).
Nhóm thứ II: gồm 7 mẫu giống là SR7, SR8, SR9, SR13, SR14, SR15 và
SR5. Các mẫu trong nhóm này có hệ số tương đồng về trình tự nucleotide dao động từ 94,32% (giữa mẫu SR7 - SR9 và SR9 - SR14) đến 99,86% (giữa mẫu SR13 và SR14). Hệ số tương đồng về trình tự nucleotide giữa các mẫu nghiên cứu trong nhóm này với mẫu tham chiếu Sarcandra glabra (dao động từ 91,66% đến 95,39%) cao hơn mẫu tham chiếu Chloranthus erectus (dao động từ 72,92% đến 77,16%).
Nhóm thứ III: gồm 5 mẫu giống là SR1, SR2, SR3, SR4 và SR6 có hệ số
tương đồng về trình tự nucleotide dao động từ 98,36% (giữa mẫu SR2 và SR4) đến 99,86% (giữa mẫu SR1 và SR3). Hệ số tương đồng về trình tự nucleotide giữa các mẫu nghiên cứu trong nhóm này với mẫu tham chiếu Chloranthus erectus (dao động từ 90,15% đến 90,82%) cao hơn mẫu tham chiếu Sarcandra glabra (dao động từ 86,12% đến 87,31%).
Kết quả thu được ở hình 3.8 cũng phù hợp với các kết quả so sánh trình tự các nucleotid vùng gen lục lạp của 15 mẫu Sói rừng khi phân tích sắp cột thẳng hàng (alignments) trình tự DNA vùng gen được giải mã cùng với trình tự tham chiếu đã được cơng bố trên GenBank. Như vậy dựa vào trình tự nucleotide nhân với marker
ITS4/ITS5 thu được 7 mẫu giống SR7, SR8, SR9, SR13, SR14, SR15 và SR5 tương
đồng cao về trình tự nucleotide với mẫu tham chiếu Sarcandra glabra (dao động từ 91,66% đến 95,39%). 5 mẫu giống là SR1, SR2, SR3, SR4 và SR6 tương đồng cao về trình tự nucleotide với mẫu tham chiếu Chloranthus erectus (dao động từ 90,15% đến 90,82%).
3.4. Kết quả nghiên cứu nhân giống in vitro cây Sói rừng
3.4.1. Chọn vật liệu khởi đầu
Căn cứ vào đặc điểm hình thái cùng với kết quả nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền (mục 3.2.3) tôi lựa chọn mẫu Sói rừng có xuất xứ Thái An, Quảm Bạ làm vật liệu ngân giống phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.4.2. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến khả năng tạo mẫu vô trùng mẫu vô trùng
Khử trùng mẫu là giai đoạn tiên quyết, là nền tảng tạo nên sự thành cơng của q trình ni cấy in vitro. Quá trình này cần đảm bảo các yêu cầu như tỷ lệ mẫu
46
sống cao, tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, mô nuôi cấy sinh trưởng tốt. Chất khử trùng HgCl2 với nồng độ 0,1% là hóa chất phổ biến, phù hợp khử trùng bề mặt các đối tượng thực vật vào mẫu dạng thân gỗ. Gốc Hg2+ có hoạt tính khử trùng mạnh. Hg2+ gây thối hóa tổ chức, tạo thành các hợp chất protein rất dễ tan làm tê liệt chức năng của các nhóm thiol (-SH), các hệ thống men cơ bản và oxi hóa khử của tế bào; Hg2+ có thể liên kết với các protein và mô, làm tê liệt và phá hủy tế bào nấm, khuẩn nhanh chóng. Trong thí nghiệm này chúng tối tiến hành khử trùng mẫu bằng dung dịch HgCl2 0,1% với khoảng thời gian khác nhau: 3 phút, 5 phút, 10 phút và 15 phút. Mẫu đối chứng khử trùng bằng nước cất vô trùng. Chồi vô trùng bề mặt được cấy chuyển vào môi trường MS không chứa chất điều hòa sinh trưởng. Kết quả nghiên cứu được trình bày trong Bảng 3.11 và Hình 3.9. (Chi tiết thành phần MS xem phụ lục 2).
Bảng 3.11. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến khả năng tạo mẫu vô trùng (sau 4 tuần nuôi cấy)
Công thức Chất khử trùng Thời gian khử trùng (phút) Tổng số mẫu (mẫu) Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm, phát sinh chồi (%) CT1 (ĐC) HgCl2 0,1 % 0 90 0,0 CT2 3 90 7,8 CT3 5 90 62,2 CT4 10 90 44,4 CT5 15 90 24,4 CV% 4,2 LSD0,05 2,5
Với kết quả phân tích số liệu LSD0,05 bằng 2,5 và CV% bằng 4,2 cho thấy các công thức thực sự khác nhau với độ tin cậy 95%.
Kết quả cho thấy CT1 (đối chứng) chỉ xử lý bằng nước cất vơ trùng tồn bộ mẫu nghiên cứu đều bị nhiễm. Khi khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 3 phút
47
tỷ lệ mẫu sống không nhiễm được cải thiện, tuy nhiên khá thấp chỉ đạt 7,8%. Tăng thời gian khử trùng lên 5 phút cho tỷ lệ mẫu sống không nhiễm cao đạt 62,2%. Tiếp tục tăng thời gian khử trùng lên 10 phút và 15 phút kết quả tỷ lệ mẫu sống không nhiễm giảm dần do thời gian tiếp xúc với HgCl2 thời gian dài mẫu bị chết nhiều. Như