ADN của 15 mẫu lá của cây Sói rừng được thu thập từ 15 xã của 05 huyện thuộc tỉnh Hà Giang sau khi tách chiết đều cho nồng độ và độ tinh sạch cao, các băng gọn sắc nét đảm bảo cho các bước thí nghiệm tiếp theo.
3.3.2. Kết quả PCR của mẫu Sói rừng nghiên cứu
Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi ITS4/ITS5 kết quả thu được cho thấy các mẫu lá thuộc 15 mẫu Sói rừng đều cho băng đơn hình với kích thước khoảng 730 bp (hình 3.7). Kết quả đảm bảo để thực hiên bước nghiên cứu giải trình tự tiếp theo.
42
Hình 3.7. Kết quả PCR của 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu với cặp mồi ITS4/ITS5; M: Marker generuler 1kb plus DNA 3.3.3. Kết quả giải trình tự vùng ITS-rDNA của mẫu Sói rừng nghiên cứu
Sản phẩm PCR với cặp mồi ITS4/ITS5 sau khi tinh sạch được phân tích trực
tiếp trên máy giải trình tự ABI PRISM 3700 DNA Analyzer (Applied Biotech) của cơng ty Macrogen (Hàn Quốc) Trình tự của 15 mẫu Sói rừng trong nghiên cứu được so sánh với trình tự gen tham chiếu đã được công bố mã số trên NCBI thông qua phần mềm MEGA v6.06.
Số liệu thu được trong bảng 3.4 của các mẫu Sói rừng có độ dài nucleotit là phù hợp với kết quả kiểm tra kích thước băng PCR ở hình 3.7. Kết quả ở bảng 3.4 cũng cho thấy, do có sự mất đoạn (InDel) hay thêm đoạn (InSert) ở một số vị trí trên đoạn gen nên số lượng nucleotit tổng số của mỗi đoạn trình tự có sự dao động giữa các mẫu nghiên cứu. Độ dài nucleotit của các mẫu dao động từ 709nu (SR10) đến 734nu (SR7, SR8, SR9 và SR14). Các mẫu SR5, SR13 có độ dài nucleotit là 733nu; mẫu SR15 có độ dài nucleotit là 732nu; các mẫu SR1, SR4 và SR6 có độ dài nucleotit là 731nu; các mẫu SR2, SR3 có độ dài nucleotit là 730nu; mẫu SR11 có độ dài nucleotit là 727nu; mẫu SR12 có độ dài nucleotit là 716nu (Phụ lục 1).
Bảng 3.9. Độ dài trình tự của 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu STT Kí hiệu Tổng số Nucleotide STT Kí hiệu Tổng số STT Kí hiệu Tổng số Nucleotide STT Kí hiệu Tổng số
Nucleotide
1 SR1 731 9 SR9 734
2 SR2 730 10 SR10 709
3 SR3 730 11 SR11 727
43
5 SR5 733 13 SR13 733
6 SR6 731 14 SR14 734
7 SR7 734 15 SR15 732
8 SR8 734
3.3.4. Kết quả phân tích đa dạng di truyền, xác định mối quan hệ di truyền giữa 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu mẫu Sói rừng nghiên cứu
Số liệu thu được ở bảng 3.10 cho thấy có sự tương đồng khá cao giữa 15 trình tự của 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu. Hệ số tương đồng về trình tự nucleotide cao nhất là 99,86% (giữa cặp mẫu SR1 - SR3 và SR13 - SR14). Hệ số tương đồng về trình tự nucleotide thấp nhất là 62,60% (giữa cặp mẫu SR1 - SR10 và SR6 - SR10). Kết quả so sánh sự tương đồng di truyền giữa 2 mẫu tham chiếu MH270480.1 Chloranthus erectus và KP317601.1 Sarcandra glabra với 15 mẫu nghiên cứu cho thấy: 15 mẫu Sói rừng có hệ số tương đồng về trình tự nucleotide với mẫu tham chiếu Chloranthus erectus dao động từ 59,21% (mẫu SR11 và Chloranthus erectus) đến 90,82% (mẫu SR2, SR3 và Chloranthus erectus). 15 mẫu Sói rừng có hệ số tương đồng về trình tự nucleotide với mẫu tham chiếu Sarcandra glabra dao động từ 66,17% (mẫu SR10 và Sarcandra glabra) đến 99,46% (mẫu SR8; SR9 và Sarcandra glabra).
44
Bảng 3.10: Hệ số tương đồng di truyền giữa 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu và 2 mẫu tham chiếu
Hình 3.8. Cây phát sinh chủng loại của 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu với mẫu tham chiếu MH270480.1 Chloranthus erectus và KP317601.1 Sarcandra glabra
Cây phát sinh loài được xây dựng dựa vào phần mềm Mega 6.0 theo phương pháp Maximum likelihood, kết quả từ 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu được phân làm 3 nhóm chính:
Nhóm thứ I: bao gồm 3 mẫu Sói rừng là SR10, SR11 và SR12) có hệ số tương
đồng về trình tự nucleotide dao động từ 95,64% (SR11 và SR12) đến 98,04% (SR10 và SR12). Hệ số tương đồng về trình tự nucleotide giữa các mẫu nghiên cứu trong nhóm này với mẫu tham chiếu Sarcandra glabra (dao động từ 66,17% đến 68,99%) cao
45
hơn mẫu tham chiếu Chloranthus erectus (dao động từ 59,21% đến 60,28%).
Nhóm thứ II: gồm 7 mẫu giống là SR7, SR8, SR9, SR13, SR14, SR15 và
SR5. Các mẫu trong nhóm này có hệ số tương đồng về trình tự nucleotide dao động từ 94,32% (giữa mẫu SR7 - SR9 và SR9 - SR14) đến 99,86% (giữa mẫu SR13 và SR14). Hệ số tương đồng về trình tự nucleotide giữa các mẫu nghiên cứu trong nhóm này với mẫu tham chiếu Sarcandra glabra (dao động từ 91,66% đến 95,39%) cao hơn mẫu tham chiếu Chloranthus erectus (dao động từ 72,92% đến 77,16%).
Nhóm thứ III: gồm 5 mẫu giống là SR1, SR2, SR3, SR4 và SR6 có hệ số
tương đồng về trình tự nucleotide dao động từ 98,36% (giữa mẫu SR2 và SR4) đến 99,86% (giữa mẫu SR1 và SR3). Hệ số tương đồng về trình tự nucleotide giữa các mẫu nghiên cứu trong nhóm này với mẫu tham chiếu Chloranthus erectus (dao động từ 90,15% đến 90,82%) cao hơn mẫu tham chiếu Sarcandra glabra (dao động từ 86,12% đến 87,31%).
Kết quả thu được ở hình 3.8 cũng phù hợp với các kết quả so sánh trình tự các nucleotid vùng gen lục lạp của 15 mẫu Sói rừng khi phân tích sắp cột thẳng hàng (alignments) trình tự DNA vùng gen được giải mã cùng với trình tự tham chiếu đã được cơng bố trên GenBank. Như vậy dựa vào trình tự nucleotide nhân với marker
ITS4/ITS5 thu được 7 mẫu giống SR7, SR8, SR9, SR13, SR14, SR15 và SR5 tương
đồng cao về trình tự nucleotide với mẫu tham chiếu Sarcandra glabra (dao động từ 91,66% đến 95,39%). 5 mẫu giống là SR1, SR2, SR3, SR4 và SR6 tương đồng cao về trình tự nucleotide với mẫu tham chiếu Chloranthus erectus (dao động từ 90,15% đến 90,82%).
3.4. Kết quả nghiên cứu nhân giống in vitro cây Sói rừng
3.4.1. Chọn vật liệu khởi đầu
Căn cứ vào đặc điểm hình thái cùng với kết quả nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền (mục 3.2.3) tôi lựa chọn mẫu Sói rừng có xuất xứ Thái An, Quảm Bạ làm vật liệu ngân giống phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.4.2. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến khả năng tạo mẫu vô trùng mẫu vô trùng
Khử trùng mẫu là giai đoạn tiên quyết, là nền tảng tạo nên sự thành công của quá trình ni cấy in vitro. Quá trình này cần đảm bảo các yêu cầu như tỷ lệ mẫu
46
sống cao, tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, mô nuôi cấy sinh trưởng tốt. Chất khử trùng HgCl2 với nồng độ 0,1% là hóa chất phổ biến, phù hợp khử trùng bề mặt các đối tượng thực vật vào mẫu dạng thân gỗ. Gốc Hg2+ có hoạt tính khử trùng mạnh. Hg2+ gây thối hóa tổ chức, tạo thành các hợp chất protein rất dễ tan làm tê liệt chức năng của các nhóm thiol (-SH), các hệ thống men cơ bản và oxi hóa khử của tế bào; Hg2+ có thể liên kết với các protein và mô, làm tê liệt và phá hủy tế bào nấm, khuẩn nhanh chóng. Trong thí nghiệm này chúng tối tiến hành khử trùng mẫu bằng dung dịch HgCl2 0,1% với khoảng thời gian khác nhau: 3 phút, 5 phút, 10 phút và 15 phút. Mẫu đối chứng khử trùng bằng nước cất vô trùng. Chồi vô trùng bề mặt được cấy chuyển vào môi trường MS không chứa chất điều hòa sinh trưởng. Kết quả nghiên cứu được trình bày trong Bảng 3.11 và Hình 3.9. (Chi tiết thành phần MS xem phụ lục 2).
Bảng 3.11. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến khả năng tạo mẫu vô trùng (sau 4 tuần nuôi cấy)
Công thức Chất khử trùng Thời gian khử trùng (phút) Tổng số mẫu (mẫu) Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm, phát sinh chồi (%) CT1 (ĐC) HgCl2 0,1 % 0 90 0,0 CT2 3 90 7,8 CT3 5 90 62,2 CT4 10 90 44,4 CT5 15 90 24,4 CV% 4,2 LSD0,05 2,5
Với kết quả phân tích số liệu LSD0,05 bằng 2,5 và CV% bằng 4,2 cho thấy các công thức thực sự khác nhau với độ tin cậy 95%.
Kết quả cho thấy CT1 (đối chứng) chỉ xử lý bằng nước cất vơ trùng tồn bộ mẫu nghiên cứu đều bị nhiễm. Khi khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 3 phút
47
tỷ lệ mẫu sống không nhiễm được cải thiện, tuy nhiên khá thấp chỉ đạt 7,8%. Tăng thời gian khử trùng lên 5 phút cho tỷ lệ mẫu sống không nhiễm cao đạt 62,2%. Tiếp tục tăng thời gian khử trùng lên 10 phút và 15 phút kết quả tỷ lệ mẫu sống không nhiễm giảm dần do thời gian tiếp xúc với HgCl2 thời gian dài mẫu bị chết nhiều. Như vậy khi khử trùng mẫu Sói rừng bằng dung dịch HgCl2 0,1% thời gian thích hợp là trong 5 phút.
Hình 3.9. Kết quả khử trùng mẫu đoạn thân Sói rừng bằng HgCl2 0,1% 3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Sói rừng
3.4.3.1. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh chồi Sói rừng
Cytokinin ảnh hưởng rõ rệt và rất đặc trưng lên sự phân hóa cơ quan của thực vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi vì vậy để tăng hệ số nhân chồi người ta đã bổ sung thêm một số chất có trong nhóm cytokinin trong mơi trường ni cấy.
Trong thí nghiệm này chúng tơi nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh chồi Sói rừng, mẫu được đưa vào mơi trường có bổ sung BAP với nồng độ từ 0 - 3mg/l. Theo dõi mẫu cấy sau 4 tuần ni cấy, kết quả nghiên cứu được trình bày trong bảng 3.12.
48
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh chồi Sói rừng (sau 4 tuần ni cấy)
Cơng thức (CT) Nồng độ BAP (mg/l) Số mẫu Hệ số nhân chồi lần 1 (lần) Hệ số nhân chồi lần 2 (lần) Hệ số nhân chồi lần 3 (lần) Hình thái chồi CT1 (ĐC) 0 90 1,0 1,0 1,03 Chồi xanh CT2 0.5 90 1,0 1,02 1,78 Chồi và hệ lá xanh, sinh trưởng phát triển
tốt
CT3 1 90 1,0 1,12 2,16
Chồi và hệ lá xanh, sinh trưởng phát triển
tốt
CT4 1.5 90 1,12 1,65 3,51
Chồi và hệ lá xanh, sinh trưởng phát triển
tốt CT5 2 90 1,41 1,45 3,22 Chồi xanh nhạt, mọng nước CT6 3 90 1,38 1,43 2,87 Chồi xanh nhạt, mọng nước LSD0,05 0,24 CV% 1,4
Với giá trị LSD00.05 đạt 0,24 các cơng thức thí nghiệm có sự sai khác nhau có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%.
CT1 (ĐC) khi không bổ sung chất kích sinh trưởng khơng có hiện tượng xuất hiện chồi mới qua 3 lần cấy chuyển. Trên các mơi trường có bổ sung BAP, đều ghi nhận có hiệu quả tăng sinh chồi. Khi bổ sung BAP có nồng độ (1 ÷ 3 mg/l) hệ số hân
49
chồi tăng dần và đạt cao nhất ở CT4 tương ứng 3,51 lần. Tiếp tục tăng nồng độ BAP lên 2mg/l và 3 mg/l hệ số nhân chồi có xu hướng giảm đồng thời chồi có hiện tượng chồi mới bị mọng nước.
Kết quả thu được có thể được giải thích như sau: BAP là một trong các cytokinin có vai trị trong việc hoạt hóa q trình phân bào, nhờ đó có tác dụng tái sinh và phân hóa chồi cho cây. Khi tăng dần nồng độ BAP trong môi trường ni cấy thì hệ số nhân chồi tăng. Nhưng khi tiếp tục tăng nồng độ BAP lên 2 mg/l không cho kết quả cao hơn đồng thời có xu hướng giảm do hàm lượng BAP cao có thể gây độc cho mẫu, từ đó gây ức chế khả năng tạo chồi cho mẫu. Kết quả nghiên cứu trên đã xác định được nồng độ BAP thích hợp nhất để nhân nhanh chồi Sói rừng là 1,5 mg/l tương ứng hệ số nhân chồi đạt 3,51 lần. Kết quả này được sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo. Hình 3.10 thể hiện hệ số nhân chồi và chất lượng chồi đạt tốt nhất ở nồng nồng BAP 1,5 mg/l
CT1 (ĐC) CT4: BAP (1,5mg/l)
Hình 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hệ số nhân chồi cây Sói rừng
3.4.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP kết hợp với Kinetin đến hệ số nhận chồi Sói rừng
Nồng độ BAP 1,5mg/l tốt nhất ở thí nghiệm 1 được kết hợp với Kinetin với dãy nồng độ khác nhau. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Sói rừng được thể hiện ở bảng 3.13.
50
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và Kinetin đến hệ số nhân chồi sau 4 tuần nuôi cấy (sau 4 tuần nuôi cấy)
Công thức (CT) Nồng độ BAP (mg/l) Nồng độ kinetin (mg/l) Số mẫu Hệ số nhân chồi lần 1 (lần) Hệ số nhân chồi lần 2 (lần) Hệ số nhân chồi lần 3 (lần) Hình thái chồi CT1 (ĐC) 1,5 0 90 1,12 1,65 3,51 Chồi và hệ lá xanh, sinh trưởng
phát triển tốt
CT2 1,5 0,2 90 1,13 1,72 3,93
Chồi và hệ lá xanh, sinh trưởng
phát triển tốt
CT3 1,5 0,4 90 1,13 1,75 4,42
Chồi và hệ lá xanh, sinh trưởng
phát triển tốt
CT4 1,5 0,6 90 1,15 1,81 4,72
Chồi và hệ lá xanh, sinh trưởng
phát triển tốt CT5 1,5 0,8 90 1,22 1,83 4,57 Chồi xanh, mọng nước CT6 1,5 1,0 90 1,25 1,81 4,16 Chồi xanh, mọng nước LSD0,05 0,14 CV% 1,9
Từ kết quả bảng 3.13 cho thấy với giá trị LSD.0.05 đạt 0,14 thì các cơng thức có sự sai khác nhau có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%, hệ số nhân chồi cao nhất ở CT4 với nồng độ BAP 1,5 mg/l kết hợp với Kinetin nồng độ 0,6 mg/l đạt hệ số nhân chồi 4,72 lần. Tiếp tục tăng nồng độ kinetin lên 0,8 mg/l và 1,0 mg/l hệ số nhân chồi có xu hướng giảm đồng thời chồi có hiện tượng bị mọng nước. Sự kết hợp giữa nồng độ BAP và Kinetin quá lớn sẽ làm giảm hệ số nhân chồi. Như vậy, nồng độ thích hợp là
51
BAP 1,5 mg/l kết hợp kinetin 0,6 mg/l. Kết quả này được sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.11 cho thấy hệ số nhân chồi cây Sói rừng thay đổi theo chiều hướng tích cực khi sử dụng tổ hợp BAP 1,5 mg/l kết hợp kinetin 0,6 mg/l.
CT1 (ĐC): BAP (1,5mg/l) CT4: BAP 1,5mg/l) + Kinetin (0,6 mg/l)
Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với Kinetin đến hệ số nhân chồi cây Sói rừng
3.4.3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP, Kinetin và NAA đến hệ số nhân chồi
Trong việc tạo chồi, auxin cũng có tác dụng tích cực khi phối hợp với cytokinin ở nồng độ thích hợp. Nhiều thí nghiệm đã chứng minh việc tạo chồi có hiệu quả khi phối hợp hai nhóm auxin và cytokinin hơn là chỉ sử dụng nhóm cytokinin một cách riêng rẽ. Theo Murashige (1980) q trình phân hố chồi phụ thuộc vào tỷ lệ auxin và cytokinin trong môi trường nuôi cấy. Nếu tỷ lệ cytokinin/auxin cao kích thích sự hình thành chồi và ngược lại sẽ kích thích sự hình thành rễ. Để tìm ra tỷ lệ phối hợp tối ưu cho môi trường nhân nhanh, chúng tôi đã tiến hành ni cấy mẫu trên mơi trường có bổ sung tổ hợp BA 1,5 mg/l và Kinetin 0,6 mg/l (công thức cho hệ số nhân chồi cao tốt nhất) phối hợp với NAA ở các nồng độ là 0,1mg/l; 0,2mg/l; 0,3mg/l; 0,4mg/; 0,5 mg/l. Kết quả theo dõi sau 4 tuần nuôi cấy được thể hiện qua bảng 3.14.
52
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và Kinetin với NAA đến hệ số nhận chồi (sau 4 tuần nuôi cấy)
Công thức (CT) Nồng độ BAP (mg/l) Nồng độ kineti n (mg/l) Nồng độ NAA (mg/l) Số mẫu Hệ số nhân chồi lần 1 (lần ) Hệ số nhân chồi lần 2 (lần ) Hệ số nhân chồi lần 3 (lần ) Hình thái chồi CT1 (ĐC) 1.5 0,6 0 90 1,15 1,81 4,72 Chồi và hệ lá xanh, sinh trưởng phát triển tốt CT2 1.5 0,6 0,1 90 1,16 1,83 4,95 Chồi và hệ lá xanh, sinh trưởng phát triển tốt CT3 1.5 0,6 0,2 90 1,16 1,85 5,85 Chồi và hệ lá xanh, sinh trưởng phát triển tốt CT4 1.5 0,6 0,3 90 1,19 1,88 5,42 Chồi và hệ lá phát triển xanh CT5 1.5 0,6 0,4 90 1,22 1,85 4,86 Chồi xanh, mọng nước CT6 1.5 0,6 0,5 90 1,25 1,87 4,78 Chồi xanh, mọng nước LSD0,05 0,93 CV% 1,4
Với kết quả phân tích số liệu LSD0,05 bằng 0,93 và CV% bằng 1,4 cho thấy các cơng thức khơng có sự khác nhau, cho nên việc sử dụng chất điều hòa sinh trưởng NAA ở các nồng độ khác nhau không ảnh hưởng đến hệ số nhân chồi của mẫu nuôi cấy.
53
Kết quả bảng 3.14 cho thấy các cơng thức có bổ sung thêm NAA cho hệ số nhân chồi cao hơn so với công thức đối chứng (công thức 1) chỉ bổ sung BAP và kinetin. Kết quả sau 4 tuần nuôi cấy: Các công thức thí nghiệm cịn lại cho hệ số nhân đạt từ 4,86 lần đến 5,85 lần. Trong đó cơng thức 3 với nồng độ NAA bổ sung là