CHƢƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.7. Tinh sạch bacteriocin
2.2.7.1. Phương pháp sắc ký trao đổi cation
Quá trình tinh sạch bacteriocin đƣợc thực hiện trên hệ thống AKTA với cột trao đổi cation HiTrap SP FF 1 mL. Dịch nuôi cấy vi khuẩn đƣợc chỉnh về pH 5,5 bằng NaOH 1 M. Các bƣớc tinh sạch bacteriocin nhƣ sau:
Cột trao đổi cation HiTrap SP FF 1 mL
Dung dịch đệm:
- Đệm A: Đệm natri acetate 0,02 M, pH 5,5
- Đệm B: Đệm natri acetate 0,02 M, pH 5,5 có bổ sung NaCl 1 M
Tốc độ dòng chảy: 1 mL/phút
Thể tích mẫu bơm lên cột: 8 mL
Giai đoạn rửa giải:
- Chƣơng trình chạy: 5 mL dung dịch đệm A + 30% đệm B; 7 mL dung dịch
đệm A + 60% đệm B; 7 mL dung dịch 100% đệm B.
Kiểm tra hoạt tính bateriocin của phân đoạn thu đƣợc bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Sau 24 - 48 giờ, vòng kháng khuẩn đƣợc quan sát.
2.2.7.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC [63]
Các phân đoạn rửa giải có hoạt tính sau cột Hitrap SP FF 1 mL đƣợc tinh sạch bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Các bƣớc tinh sạch bacteriocin nhƣ sau:
Cột sắc ký: Cột Semi C4 Dionex
Dung dịch đệm:
- Đệm A: Nƣớc MilliQ có bổ sung 0,1% TFA (v/v) (Acid trifluoroacetic)
- Đệm B: Dung dịch acetonitrile 100%
Tốc độ dòng chảy: 2 mL/phút
Thể tích mẫu bơm lên cột: 1 mL
Chƣơng trình chạy (55 phút): 0 - 10 phút (0 - 10% B); 10 - 25 phút (10 - 25% B); 25 - 45 phút (25 - 100% B) và 45 - 55 phút (100% B). Protein đƣợc theo dõi ở độ hấp thụ 280 nm
Các đỉnh đƣợc thu sau q trình rửa giải, cơ đặc và bảo quản ở -20oC. Hoạt tính bateriocin đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Sau 24 - 48 giờ, vòng kháng khuẩn đƣợc quan sát.
2.2.7.3. Xác định protein tổng số theo phương pháp Bradford
Phƣơng pháp Bradford dựa trên nguyên lý phản ứng của protein với thuốc thử Coomassie Brilliant Blue (CBB) qua việc hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bƣớc sóng 595 nm với cƣờng độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong dung dịch. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là độ nhạy cao, cho phép phát hiện vài g protein/mL, dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian.
1 mL thuốc thử Bradford 5x (0,01 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 hòa tan trong 5 mL ethanol 95%, 10 mL acid phosphoric (H3PO4) 85% và 85 mL H2O) đƣợc bổ sung 20 L mẫu, lắc đều và giữ ở nhiệt độ phòng khoảng 5 - 10 phút. Mẫu chuẩn là dung dịch Albumin nồng độ 0,2 mg/mL và các mẫu đƣợc đo ở bƣớc sóng 595 nm. Dựa vào mẫu chuẩn để xác định hàm lƣợng protein [21].
2.2.8. Phương pháp thống kê sinh học
- Các thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình - Sử dụng Microsoft Exel để xử lý số liệu.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic sinh bacteriocin và định danh
3.1.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic sinh bacteriocin
38 chủng vi khuẩn lactic đã đƣợc phân lập từ 10 mẫu thực vật (lô hội, sung, cải xanh, chanh, rau muống, ngải cứu, lá lốt, húng quế, mồng tơi và càng cua). Trong đó, 10 chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp bateriocin kháng 5 chủng vi sinh vật kiểm định đƣợc xác định bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Nguồn mẫu thu thập, ký hiệu các chủng vi khuẩn và hoạt tính kháng khuẩn đối với các chủng kiểm định đƣợc trình bày trong Bảng 3.1 và Bảng 3.2.
Bảng 3.1. Các chủng vi khuẩn lactic đƣợc phân lập
STT Nguồn phân lập Ký hiệu các chủng phân lập Số chủng phân lập Chủng lựa chọn 1 Cải xanh
(Brassica juncea L.) UL789 - UL792 4 UL789
2 Sung
(Ficus racemosa) UL796 - UL799 4 UL797
3 Rau muống
(Ipomoea aquatica Forssk) UL807 - UL810 4 UL809
4 Lô hội
(Aloe Vera) UL811 - UL814 4 UL814
5 Rau càng cua
(Peperomia pellucida) UL815 - UL817 3 UL816
6 Chanh
(Citrus aurantifolia) UL818 - UL820 3 UL820
7 Mồng tơi
(Basella alba L.) UL821- UL825 4 UL823
(Artemisia vulgris L.)
9 Lá lốt
(Piper lolot C.) UL842 - UL847 6 UL842
10 Húng quế
(Ocimum basilicum L.) UL848 - UL849 2 UL849
Tổng 38 chủng
Bảng 3.2. Khả năng kháng vi khuẩn kiểm định của các chủng lựa chọn
STT Chủng lựa chọn Hoạt tính kháng khuẩn KĐ24 KĐ26 KĐ28 KĐ32 KĐ34 1 UL789 ++ + ++ ++ ++ 2 UL797 ++ + ++ ++ + 3 UL809 ++ - ++ +++ + 4 UL814 ++ + ++ +++ + 5 UL816 ++ + ++ +++ + 6 UL820 ++ + ++ ++ + 7 UL823 ++ + ++ +++ + 8 UL830 +++ +++ +++ +++ +++ 9 UL842 ++ + ++ ++ + 10 UL849 ++ + + ++ +
(-): khơng xuất hiện vịng kháng khuẩn; (+): đƣờng kính vịng kháng khuẩn <8mm; (++): đƣờng kính vịng kháng khuẩn từ 8 - 12mm; (+++) đƣờng kính vịng kháng khuẩn >12mm
Kết quả Bảng 3.2 cho thấy trong 10 chủng vi khuẩn đã đƣợc kiểm tra tính kháng khuẩn bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch thì chủng UL830 có hoạt
tính bacteriocin mạnh nhất (d > 12mm) nên chủng này đƣợc chúng tôi lựa chọn để tiến hành xác định hoạt độ bacteriocin và định danh.
3.1.2. Hoạt độ bacteriocin của chủng UL830
Hoạt độ AU/mL của chủng UL830 đƣợc tiến hành xác định với 5 chủng vi khuẩn kiểm định tại mục 2.1.2. Hoạt độ bacteriocin đƣợc tính theo công thức tại mục 2.2.3 và kết quả đƣợc thể hiện trong Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Hoạt độ bacteriocin sinh tổng hợp bởi chủng UL830
STT Chủng vi khuẩn kiểm định Hoạt độ bacteriocin (AU/mL)
1 Micrococcus luteus IFO 12708 910 2 Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 1935 1830 3 Lactobacillus sakei subsp. sakei JCM 1157 3650 4 Pediococcus pentosaceus JCM 5885 910 5 Enterococcus faecalis JCM 5803T 460
Kết quả cho thấy, bacteriocin sinh tổng hợp bởi chủng UL830 có phổ hoạt tính khá rộng, trong đó hoạt độ kháng vi khuẩn kiểm định Lactobacillus sakei
subsp. sakei JCM 1157 là cao nhất. Vì thế, chủng vi khuẩn kiểm định này đƣợc sử dụng để đánh giá hoạt tính bacteriocin trong những thí nghiệm tiếp theo.
3.1.3. Định danh chủng UL830
DNA genome của chủng vi khuẩn UL830 và sản phẩm của phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rDNA khi sử dụng DNA genome này làm khn đƣợc trình bày trong Hình 3.1A và Hình 3.1B tƣơng ứng. Kết quả cho thấy sản phẩm PCR có 1 băng đặc hiệu duy nhất với kích thƣớc khoảng 1500 bp.
Hình 3.1. Kết quả điện di DNA genome của chủng UL830 (A) và điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA (B)
Sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA đƣợc giải trình tự ở hãng First Base và kết quả cho thấy trình tự này tƣơng đồng 99,80% với trình tự chủng
Lactobacillus plantarum JCM 1149. Nhƣ vậy, dựa trên trình tự 16S rDNA, chủng
UL830 đƣợc định danh là Lactobacillus plantarum.
3.2. Nghiên cứu điều kiện phù hợp cho khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng vi khuẩn L. plantarum UL830 bacteriocin của chủng vi khuẩn L. plantarum UL830
3.2.1. Thời gian nuôi cấy
Để xác định thời điểm ni cấy thích hợp cho sự sinh tổng hợp bacteriocin của chủng vi khuẩn L. plantarum UL830, chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng này
trong môi trƣờng MRS lỏng ở 30oC. Mẫu đƣợc thu tại các thời điểm 24 giờ, 48 giờ,
B A DNA genome bp 5000 3000 1500 300 DNA 5000 bp 830 ĐC (-) bp 5000 1500 1000 DNA 5000 bp
72 giờ và xác định hoạt tính bacteriocin trên mơi trƣờng MRS thạch có chứa vi khuẩn kiểm định Lactobacillus sakei subsp. sakei JCM 1157 (KĐ28) (Hình 3.2).
Hình 3.2. Hoạt tính bacteriocin của chủng L. plantarum UL830 tại các thời điểm nuôi cấy khác nhau
MRS: môi trƣờng không chứa vi sinh vật; 24h, 48h, 72h là dịch nuôi cấy của chủng L. plantarum UL830 đƣợc thu tại các thời điểm 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ tƣơng ứng.
Kết quả cho thấy, tại thời điểm 24 giờ, tế bào có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin lớn nhất (đƣờng kính vịng kháng khuẩn là 7 ± 0,01 mm). Tại thời điểm 48 giờ, hoạt tính kháng khuẩn thấp hơn. Khi tăng thời gian nuôi cấy lên 72 giờ thì hoạt tính bacteriocin bị giảm cịn 85 ± 0,05%. Khi kéo dài thời gian nuôi cấy, chủng vi khuẩn sẽ bƣớc vào pha suy vong, lƣợng tế bào chết tăng nhanh nên có thể ảnh hƣởng lớn đến sự sinh tổng hợp bacteriocin. Ngoài ra, cũng có khả năng chủng vi khuẩn sẽ sinh ra các loại enzyme ngoại bào (bao gồm cả protease) làm phân giải bacteriocin do nó có bản chất là protein [69]. Bên cạnh đó, axit lactic sản sinh ra từ quá trình lên men lactic đủ lớn có thể gây ức chế sự sinh trƣởng của chính vi khuẩn này.
3.2.2. Nhiệt độ nuôi cấy
Nhiệt độ nuôi cấy là một trong những yếu tố của mơi trƣờng có ảnh hƣởng lớn đến sự sinh trƣởng và tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học của vi sinh vật. Do đó, việc xác định nhiệt độ tối ƣu là cần thiết đối với quá trình nghiên cứu.
trƣờng MRS lỏng ở các nhiệt độ 30oC, 37oC và 40oC trong điều kiện tĩnh. Mẫu đƣợc thu nhận sau 24 giờ nuôi cấy và kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn với
Lactobacillus sakei subsp. sakei JCM 1157. Kết quả đƣợc thể hiện qua Hình 3.3.
Hình 3.3. Hoạt tính bacteriocin của chủng L. plantarum UL830 tại các nhiệt độ nuôi cấy khác nhau
MRS: môi trƣờng không chứa vi sinh vật; 30o
C, 37oC, 40oC là dịch nuôi cấy vi khuẩn L.
plantarum UL830 ở các nhiệt độ tƣơng ứng trong điều kiện nuôi tĩnh.
Kết quả cho thấy ở 37oC chủng L. plantarum UL830 sinh tổng hợp
bacteriocin yếu; ở 40oC chủng UL830 bị mất hoạt tính hồn tồn cịn ở 30oC thì hoạt tính này là lớn nhất sau 24 giờ ni cấy với đƣờng kính vịng kháng khuẩn là 7 ± 0,03 mm.
Nhƣ vậy, điều kiện nuôi cấy phù hợp đối với chủng L. plantarum UL830 để thu nhận lƣợng bacteriocin là trên môi trƣờng lỏng MRS ở 30oC trong 24 giờ. Điều kiện này cũng tƣơng tự nhƣ điều kiện nuôi cấy tối ƣu của chủng L. plantarum
VGW8 trong nghiên cứu của Ali và đồng tác giả (2015) [15].
3.3. Một số tính chất của bacteriocin từ chủng vi khuẩn L. plantarum UL830
3.3.1. Hoạt tính kháng khuẩn
Với mục đích sử dụng bacteriocin sinh tổng hợp từ chủng UL830 trong bảo quản thực phẩm và y dƣợc, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn từ dịch nuôi cấy của chủng UL830 với 10 chủng vi sinh vật gây bệnh (Bảng 2.2). Trong số đó, có 5 chủng khơng bị ức chế gồm Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae và Enterococcus
faecalis (kết quả khơng trình bày ở đây). Kết quả kháng 5 chủng vi khuẩn kiểm định
cịn lại đƣợc trình bày trong Hình 3.4 và Bảng 3.4.
Acinetobacter baumannii VTCCB 823 Salmonella enterica VTCCB 480
Staphylococcus aureus VTCCB 658 Bacillus cereus VTCCB 613
Vibrio parahaemolyticus VTCCB 652
Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của chủng UL830
MRS pH 4, MRS pH 5, MRS pH 6: môi trƣờng MRS không chứa vi sinh vật đƣợc chỉnh pH đến các giá trị 4, 5, 6 tƣơng ứng. MRS pH4 MRS pH5 MRS pH6 830 830 MRS pH4 MRS pH5 MRS pH6 830 830 MRS pH4 MRS pH5 MRS pH6 830 830 MRS pH4 MRS pH5 MRSpH6 830 830 MRS pH4 MRS pH5 MRS pH6 830 830
Bảng 3.4. Kết quả đƣờng kính vịng kháng khuẩn STT Chủng vi sinh vật gây bệnh Đƣờng kính vịng kháng STT Chủng vi sinh vật gây bệnh Đƣờng kính vịng kháng khuẩn (D – d, mm) 1 Acinetobacter baumannii VTCCB 823 6,5 ± 0,04 2 Salmonella enterica VTCCB 480 5,5 ± 0,10 3 Staphylococcus aureus VTCCB 658 7,5 ± 0,02 4 Bacillus cereus VTCCB 613 6,0 ± 0,01 5 Vibrio parahaemolyticus VTCCB 652 6,75 ± 0,15
Một số bacteriocin có tính đặc hiệu cao và chỉ có thể ức chế các chủng có quan hệ gần gũi [18,52]. Theo Smaoui và đồng tác giả (2010), bacteriocin
BacTN635 đƣợc sản xuất bởi L. plantarum sp. TN635 kháng 4 vi khuẩn Gram âm
(Salmonella enterica ATCC43972, Pseudomonas aeruginosa ATCC 49189, Hafnia sp. và Serratia sp) và nấm gây bệnh Candida tropicalis R2 CIP203 [70]. Hợp chất
kháng khuẩn sinh tổng hợp từ chủng L. plantarum ZJ217 không ức chế Salmonella spp. và Lactobacillus spp., nhƣng kháng các vi khuẩn Gram âm và Gram dƣơng nhƣ
Bacillus spp., Escherichia spp., Shigella dysenteriae, Pseudomonas spp., Staphylococcus spp., và Listeria monocytogenes [88].
Trong nghiên cứu của chúng tơi, bacteriocin đƣợc sản xuất bởi chủng UL830 có phổ kháng khuẩn khá rộng, có hoạt tính ức chế sự phát triển của vi khuẩn Gram dƣơng nhƣ S. aureus, B. cereus và Gram âm nhƣ A. baumannii, S. enterica, V. parahaemolyticus. Trong đó, đƣờng kính vịng kháng khuẩn kháng S. aureus là lớn
nhất (đạt khoảng 7,5 ± 0,02 mm). Các chủng vi khuẩn này là một trong những tác nhân gây bệnh phổ biến ở ngƣời và động vật nhƣ ngộ độc thực phẩm, viêm dạ dày, ruột; ngồi ra, chúng cịn gây trở ngại trong việc điều trị các bệnh nhiễm trùng bằng kháng sinh do kháng nhiều thuốc. Kết quả này cũng tƣơng tự chủng L. plantarum lp 31 trong nghiên cứu của Muller và cộng sự (2009) [54].
Nhƣ vậy chúng tơi có thể sơ bộ kết luận rằng, bacteriocin của chủng UL830 có phổ kháng khuẩn khá rộng và đây là tiền đề trong việc ứng dụng bacteriocin của chủng vi khuẩn này vào lĩnh vực công nghệ thực phẩm và y dƣợc.
3.3.2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacteriocin từ chủng UL830
Hoạt tính bacteriocin của chủng L. plantarum UL830 tại các pH khác nhau nhƣ 5, 6, 7, 8, 9 và 10 cũng đƣợc tiến hành khảo sát với vi khuẩn kiểm định. Nếu cho hoạt tính kháng khuẩn của dịch nuôi cấy ban đầu là 100% và hoạt tính kháng khuẩn tại các pH khác đƣợc tính theo hoạt tính ban đầu thì ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính bacteriocin từ chủng L. plantarum UL830 đƣợc thể hiện trong Hình 3.5.
Hình 3.5. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacteriocin từ chủng L. plantarum UL830
Kết quả cho thấy, bacteriocin đƣợc sinh tổng hợp bởi chủng L. plantarum UL830 hoạt động trong dải pH tƣơng đối rộng. Hoạt tính bacteriocin lớn nhất đƣợc quan sát ở mẫu khơng xử lý với đƣờng kính 7,5 ± 0,02 mm. Ở các pH cao hơn từ 6 - 8, hoạt tính bacteriocin khá ổn định (cịn khoảng 98,67 ± 0,17% hoạt tính ban đầu). Theo Bromberg và đồng tác giả (2004), bacteirocin sản xuất bởi L.
plantarum giữ đƣợc hoạt tính kháng khuẩn trong phạm vi pH axit từ 2 - 6 và bị
bất hoạt tại pH 7 - 9 [23]. Bacteriocin C8 đƣợc tìm thấy trong chủng L. plantarum phân lập từ mẫu dƣa chua (Trung Quốc) hoạt động ổn định trong
phạm vi pH từ 3 đến 6 [87]. Nhƣng trong trƣờng hợp này, bacteiocin của chủng
L. plantarum UL830 vẫn hoạt động khá tốt tại pH 8 và pH 9; còn ở pH 10 hoạt
tính này cịn lại 82,22 ± 0,22% sau 1 giờ. Sau 3 giờ, hoạt tính bacteriocin sinh tổng hợp bởi chủng UL830 đều bị ảnh hƣởng ở các pH khác nhau (hoạt tính bactericon cịn 57,14 ± 0,03% ở pH 10) (kết quả khơng trình bày ở đây).
3.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin từ chủng UL830
Chúng tơi tiến hành khảo sát hoạt tính bacteriocin từ chủng L. plantarum
UL830 tại các mốc nhiệt độ 60oC, 100oC và 121oC theo thời gian. Nếu cho hoạt tính kháng khuẩn của dịch nuôi cấy ban đầu không xử lý là 100% và hoạt tính kháng khuẩn tại các thời điểm khác nhau đƣợc tính theo hoạt tính ban đầu thì ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin từ chủng L. plantarum UL830 đƣợc thể hiện trong Hình 3.6.
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin từ chủng L. plantarum UL830
Theo nghiên cứu của Sifour và đồng tác giả (2012), bacteriocin đƣợc sinh tổng hợp bởi L. plantarum F12 giữ nguyên hoạt tính sau 30 phút ở 100oC nhƣng hoạt tính bị giảm sau 60 phút [69]. Bacteriocin sinh tổng hợp từ L. plantarum PM4 phân lập từ thịt bò lên men vẫn giữ nguyên hoạt tính ở 60oC trong 60 phút, nhƣng bị mất khi đun nóng 100oC hoặc hấp khử trùng [38]. Trong nghiên cứu của chúng tôi,
bacteriocin đƣợc sinh tổng hợp bởi chủng L. plantarum UL830 vẫn giữ nguyên hoạt tính trong 60 phút ở 100oC; cịn ở điều kiện 121oC trong 15 phút hoạt tính này cịn lại 72,44 ± 0,41%. Khả năng bền nhiệt của bacteriocin sinh tổng hợp bởi L. plantarum UL830 là đặc tính quan trọng trong hƣớng nghiên cứu ứng dụng vì q
trình bảo quản thực phẩm có nhiều giai đoạn cần đến sự gia nhiệt.
Nhƣ vậy có thể đánh giá sơ bộ là bacteriocin đƣợc sinh tổng hợp bởi chủng L. plantarum UL830 khá bền với nhiệt và có khả năng hoạt động trong
khoảng pH khá rộng.