Chƣơng 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN PET22TRXHA5-1
3.1.1. Chuyển gen ha5-1 vào vector biểu hiện pET22trx
Gen ha5-1 đã được tách dòng trong vector pCR2.1 và được gọi là pCRha5-1.
Trong quá trình thiết kế mồi để tách dòng gen, phòng Kỹ thuật di truyền đã đưa trình tự nhận biết của 2 enzyme cắt giới hạn NcoI và BamHI vào hai đầu của gen ha5-1, nên việc sử dụng chính hai enzyme này có thể thu đoạn gen ha5-1 từ vector
tách dòng pCRha5-1 mà khơng ảnh hưởng đến trình tự của gen. Gen được đưa vào vector bằng cặp enzyme này sẽ đảm bảo gen được gắn xuôi chiều promoter và đúng khung đọc. Vector pET22trx được xử lý bằng các enzyme tương ứng để tạo đầu dính tương thích. Khi nằm trong hỗn hợp phản ứng lai ghép, các đầu dính có trình tự bổ sung sẽ bắt cặp với nhau và enzyme T4 DNA ligase sẽ tham gia xúc tác cho phản ứng hình thành liên kết phosphodiester giữa hai nucleotide đứng cạnh nhau tạo thành vector hồn chỉnh đóng vịng. Phản ứng lai ghép này được thực hiện ở 16°C trong 3 giờ.
Sản phẩm lai được biến nạp vào tế bào E. coli DH5α bằng phương pháp sốc
nhiệt và được nuôi cấy trên đĩa thạch chứa môi trường LBA. Kết quả, sau khi nuôi cấy qua đêm ở 37oC, rất nhiều khuẩn lạc đã mọc lên chứng tỏ hiệu quả biến nạp tốt. Trên đĩa mơi trường chọn lọc có ampicillin, chỉ những tế bào vi khuẩn E. coli mang các dòng plasmid chứa gen kháng kháng sinh mới có thể sống sót và sinh trưởng trên đĩa thạch. Như vậy, những khuẩn lạc quan sát thấy trên đĩa thạch là những dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp.
Trong sản phẩm vector cắt bằng NcoI và BamHI có thể vẫn cịn vector chỉ
được cắt bằng 1 enzyme hạn chế. Vì vector pET22trx có kích thước lớn và đoạn DNA giới hạn bởi NcoI và BamHI trong vùng đa nối bị cắt bỏ khỏi vector quá nhỏ nên không thể phân tách được vector đã được cắt hoàn toàn bằng hai enzyme cũng như sản phẩm vector mới chỉ được cắt bởi một enzyme. Do đó, sản phẩm của phản ứng lai ghép sẽ gồm cả vector tái tổ hợp mang gen ngoại lai ha5-l và vector
không mong muốn và lựa chọn các dòng tái tổ hợp, chúng tôi đã tiến hành tách plasmid từ các thể biến nạp để kiểm tra.
Trong 4 dòng plasmid chúng tơi đã tách chiết thì tồn bộ 4 dịng đều có kích thước lớn hơn vector pET22trx (Hình 3.2).
Vì plasmid tái tổ hợp mang gen ngoại lai nên plasmid pET22trxha5-l có kích thước lớn hơn vector pET22trx. Theo lý thuyết thì plasmid pET22Trx di chuyển nhanh hơn plasmid tái tổ hợp pET22Trxha5-1 trên gel agarose. Như vậy, các dòng plasmid đã được kiểm tra ở trên có mang gen ngoại lai. Tuy nhiên, để khẳng định gen ngoại lai này có phải là ha5-l khơng thì chúng tơi tiến hành cắt dịng plasmid
này với các enzyme cắt giới hạn.
3.1.2. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22trxha5-l bằng enzyme cắt giới hạn
Để kiểm tra xem đoạn gen chèn vào vector pET22trx có đúng là ha5-1 hay
khơng, chúng tôi tiến hành cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng cặp enzyme cắt giới hạn NcoI và BamHI. Vector pET22trx cũng được xử lý bằng cặp enzyme này để
làm đối chứng.
Theo lý thuyết, vector pET22trx có kích thước 5904 bp, mang trình tự nhận biết của hai enzyme NcoI và BamHI ở cách nhau 14 bp. Do đó, khi xử lí vector này
Hình 3.2: Phân tích sản phẩm tách chiết DNA plasmid trên gel agarose 0,8%. 1-4: Plasmid tái tổ
hợp pET22Trxha1; 5: Plasmid đối chứng (pET22Trx)
pET22Trxha5-1
1 2 3 4 5
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 M
với hai enzyme cắt hạn chế sẽ thu được hai đoạn DNA có kích thước tương ứng là 5,9 kb và 14 bp. Enzyme NcoI và BamHI nằm ở đầu gen ha5-1 nên khi cắt bằng cặp enzyme này sẽ giải phóng ra đoạn gen ha5-1 có kích thước xấp xỉ 1 kb và vector
pET22Trx có kích thước 5,9 kb.
Quan sát kết quả điện di (Hình 3.3) chúng tơi thấy trên các đường chạy từ số 2 đến số 5 tương ứng với sản phẩm cắt của dòng plasmid tái tổ hợp xuất hiện hai băng DNA có kích thước tương ứng khoảng 1 kb và 5,9 kb. Ngoài ra, trên điện di đồ cịn thấy có 1 băng kích thước lớn hơn 5,9 kb. Dịng đối chứng khi cắt bằng 2 enzyme chỉ tạo ra đoạn DNA có kích thước tương đương 5,9 kb đúng như tính tốn lý thuyết. Như vậy có thể nói đoạn DNA kích thước lớn hơn 5,9 kb xuất hiện trong sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp là do plasmid được cắt khơng hồn tồn. Đoạn DNA kích thước 1 kb tương ứng với kích thước gen ha5-l được cắt ra khỏi vector
và đoạn gen kích thước 5,9 kb là vector.
Để khẳng định chính xác hơn, gen ha5-l trong plasmid pET22trx đã được
giải trình tự. Kết quả gen đã được tách dòng tương đồng 100% với đoạn gen mã hóa tiểu phần HA1 trên ngân hàng gen, mã số AJ867074. Như vậy vector pET22Trxha5-1 đã được thiết kế thành công.
5,9 kb
pET22Trx
Ha5-1 1 kb
Hình 3.3: Phân tích sản phẩm cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp (pET22Trxha5-1) bằng enzym cắt
giới hạn NcoI và BamHI . 1: plasmid pET22Trx (Đối chứng) ; 2-5: các dòng plasmid tái tổ hợp; M: Thang ADN chuẩn 1Kb (Fermentas).
1 2 3 4 5 M