Chƣơng 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRXHA5-
TRXHA5-1 TRONG E. COLI
Quá trình tổng hợp protein ngoại lai trong tế bào vi khuẩn E.coli chịu ảnh
hưởng của rất nhiều yếu tố. Để thu được lượng lớn protein trong một lần nuôi cấy cần phải tiến hành tối ưu các điều kiện ni cấy của nó như: nhiệt độ, thời gian và nồng độ chất cảm ứng.
Hình 3.5: Protein từ chủng E. coli BL21 tái tổ hợp mang gen trxha5-1; 1: Protein không tan;
2: Protein dạng tan; 3: Thang protein chuẩn (Fermentas)
kDa 116 66 45 35 25 18,4 14,4 TrxHA5-1 1 2 3
3.3.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự biểu hiện của gen ha5-l
Nhiệt độ thường có ảnh hưởng rất lớn đối với quá trình sinh tổng hợp và hình thành cấu trúc của protein tái tổ hợp.
Trong thí nghiệm này, để khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ với quá trình tổng hợp protein TrxHA5-1, chúng tôi tiến hành nuôi cấy cảm ứng ở nhiệt độ 22°C, 28°C, 30°C, 37°C. Sau 4 giờ nuôi cấy cảm ứng, tế bào được thu lại và kiểm tra mức độ biểu hiện của protein bằng cách điện di trên gel polyacrylamide 12% có SDS. Kết quả được trình bày như ở hình 3.6.
Quan sát kết quả điện di kiểm tra, ta thấy lượng protein tái tổ hợp TrxHA5-l được tổng hợp ở nhiệt độ khác nhau là khác nhau, trong đó, băng protein TrxHA5-l biểu hiện đậm nhất ở 30°C. Như vậy ở 30o
C protein ngoại lai được tổng hợp nhiều nhất. Với kết quả này, chúng tôi lựa chọn 30°C cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ IPTG đến sự biểu hiện của gen ha5-l
IPTG là chất cảm ứng đắt tiền và ở nồng độ cao có thể gây độc cho tế bào, trong khi ở nồng độ thấp protein ngoại lai thường được tổng hợp kém. Vì thế, để lựa chọn nồng độ IPTG thích hợp nhất cho q trình ni cấy với mục đích thu được
5,9 kb
Hình 3.6: Protein tổng số từ chủng tái tổ hợp E. coli BL21 mang vector pET22Trxha5-1 được
cảm ứng bằng 0,5 mM IPTG ở các nhiệt độ khác nhau; 1-4 : Nhiệt độ cảm ứng tương ứng 22o
C, 28oC, 30oC, 37oC; 5:Thang protein chuẩn (Fermentas)
kDa 116 66 45 35 25 18.4 14.4 TrxHA5-1 1 2 3 4 5
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
lượng lớn protein và tiết kiệm chi phí sản xuất, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng biểu hiện của protein tái tổ hợp TrxHA5-l ở các nồng độ cảm ứng khác nhau (0,1; 0,5; 1,0; 1,5; và 2 mM) và protein dạng không tan được kiểm tra bằng điện di trên gel gel polyacrylamide . Kết quả (Hình 3.7) cho thấy, nồng độ IPTG ảnh hưởng khơng nhiều tới q trình biểu hiện protein ngoại lai, tuy nhiên nếu ở nồng độ q ít thì protein tái tổ hợp được tổng hợp ra với một lượng tương đối nhỏ.
Như vậy để đảm bảo thu được lượng lớn protein, đồng thời tiết kiệm chi phí sản xuất chúng tơi lựa chọn nồng độ IPTG là 0,5 mM để biểu hiện protein tái tổ hợp.
3.3.3. Lựa chọn thời điểm thu mẫu thích hợp
Thơng thường, tế bào chỉ sinh trưởng đến một nồng độ nhất định rồi dừng lại. Nếu thu tế bào quá muộn, nhiều tế bào già bị chết nên hàm lượng protein tái tổ hợp trong tế bào giảm đi. Trong thí nghiệm này, chúng tơi tiến hành thu tế bào theo thời gian để kiểm tra lượng TrxHA5-1 pha khơng tan.
Hình 3.7: Protein tổng số từ chủng tái tổ hợp E. coli BL21 mang vector pET22Trxha5-1
được cảm ứng ở các nồng độ IPTG khác nhau; 1-5 : Nồng độ chất cảm ứng IPTG tương ứng 0,1mM, 0,5mM, 1 mM, 1,5 mM: 2 mM; 6: Thang protein chuẩn (Fermentas)
kDa 116 66 45 35 25 18.4 14.4 5,9 kb TrxHA5-1 1 2 3 4 5 6
Kết quả (Hình 3.8) cho thấy tế bào bắt đầu sinh tổng hợp protein ngay từ những giờ đầu và tăng dần theo thời gian (từ 0 giờ đến 3 giờ). Sau 4 giờ nuôi cấy cảm ứng, tế bào trong môi trường sinh trưởng đã đạt đến mức tối đa và đạt đến pha cân bằng. Lúc này quá trình sinh tổng hợp protein tái tổ hợp TrxHA5-1 diễn ra mạnh và gần như đạt đỉnh điểm. Như vậy, khả năng sinh tổng hợp protein tái tổ hợp TrxHA5-1 phụ thuộc vào pha sinh trưởng của tế bào. Lượng protein thu được cao nhất sau 4 giờ nuôi cấy cảm ứng .
Kết luận: từ những kết quả thu được về các điều kiện tối ưu, chúng tôi lựa chọn điều kiện nuôi cấy để đạt được lượng lớn protein tái tổ hợp ở 30°C, nồng độ chất cảm ứng là 0,5 mM và thời gian là 4 giờ sau khi nuôi cấy cảm ứng.