Như vậy, trong tổng số 264 bệnh nhân có 16 bệnh nhân có bất thường về nhiễm sắc thể đồ chiếm tỷ lệ 6%, cịn lại 248 bệnh nhân có nhiễm sắc thể đồ bình thường chiếm 94%.
Bất thường NST là nguyên nhân chính trong rất nhiều nguyên nhân gây vô sinh nam giới do không sản xuất được tinh trùng hoặc có rất ít tinh trùng. Cơ chế chính xác về bất thường NST gây vơ sinh nam giới cũng cịn nhiều vấn đề đang tranh luận, nhưng các tác giả đều cho rằng bất thường NST có ảnh hưởng tới q trình sinh tinh trùng.
Mặc dù có nhiều tác giả trên thế giới nghiên cứu về bất thường NST trên bệnh nhân vô sinh nam giới. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu của các tác giả ở mỗi nước và khu vực cũng khác nhau.
Bảng 3.2: Tỷ lệ bất thƣờng nhiễm sắc thể đồ của một số tác giả
Tác giả
Số bệnh nhân vô sinh
nam Số trƣờng hợp bất thƣờng NST Tỷ lệ bất thƣờng(%) Koulischer L [32] 1000 33 3,3 Chandley AC [21] 2372 51 2,1 Abyholm T [14] 356 34 9,5 Zuffardi O [68] 2542 215 8,6 Abramsson L [13] 342 10 2,9 Micic M [40] 820 54 6,6 Retief AE [49] 496 35 7,0 Bourrouillou G [20] 952 98 10,3 Bonduelle M [60] 568 14 2,4 Trung Thị Hằng [4] 37 9 24 Nguyễn Đức Nhự [9] 125 26 20,8
Nghiên cứu này 264 16 6
Theo thống kê kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ bất thường NST trong nghiên cứu này là 6%, ở nhóm trung bình. Đặc biệt tỷ lệ bệnh nhân bất thường về nhiễm sắc thể đồ thấp hơn so với tỷ lệ của tác giả Trung Thị Hằng (2007) đưa ra là 24% khi nghiên cứu trên 37 trường hợp vô sinh nam giới [4]. Tác giả Nguyễn Đức Nhự (2009) khi nghiên cứu trên 125 trường hợp vô sinh nam giới đưa ra tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể đồ là 20,8% [9]. Nhìn chung, qua nghiên cứu của các tác giả cho thấy tỷ lệ bất thường NST ở bệnh nhân vô sinh nam giới ở từng nghiên cứu là khác nhau, tỷ lệ này
thay đổi từ 2,1% tới 24%. Tỷ lệ trên khác nhau có thể do khác về số lượng bệnh nhân nghiên cứu, khác về việc chọn địa điểm thời gian nghiên cứu, cách chọn mẫu: nghiên cứu của chúng tôi chọn mẫu ngẫu nhiên, một số nghiên cứu khác chọn mẫu kiểu thuận tiện. Càng ngày càng có nhiều nhân tố ảnh hưởng tới khả năng sinh sản của nam giới trong độ tuổi sinh sản khơng chỉ có ngun nhân bất thường NST, hiện nay số lượng nam giới đi khám vô sinh ngày càng nhiều.
Như vậy, từ các kết quả nghiên cứu trên cho thấy việc xét nghiệm bất thường NST đối với các bệnh nhân vô sinh nam giới do KCTT hoặc ITT là rất cần thiết để từ đó phát hiện những bất thường nhiễm sắc thể đồ, tìm ngun nhân vơ sinh và đưa ra các tư vấn di truyền hợp lí.
3.2.2 Phân bố bất thường NST thường và NST giới tính về số lượng và cấu trúc
Bảng 3.3: Phân bố về bất thƣờng NST thƣờng và NST giới tính về số lƣợng và cấu trúc của bệnh nhân vô sinh nam giới.
Bất thƣờng NST Bất thƣờng về số lƣợng NST Bất thƣờng về cấu trúc NST Tổng số (%) NST thƣờng 1 4 5 (31,25%) NST giới tính 10 1 11 (68,75%) Tổng số 11 5 16 (100%)
Kết quả thu được cho thấy có 11/16 trường hợp bất thường về NST giới tính, chiếm tỷ lệ 68,75% tổng số các trường hợp bất thường NST. Trong đó bất thường về số lượng NST giới tính là 10/11 trường hợp, cịn lại 1 trường hợp bất thường về cấu trúc của NST giới tính.
Bất thường NST thường có 5/16 trường hợp bất thường NST, chiếm tỷ lệ 31,25%. Trong đó, bất thường số lượng NST thường có 1/5 trường hợp, cịn lại 4/5 trường hợp có bất thường bất thường về cấu trúc NST thường.
Bảng 3.4: Tỷ lệ bất thƣờng NST thƣờng và NST giới tính của một số tác giả
Tác giả
Số bệnh nhân vô sinh
nam giới Số trƣờng hợp bất thƣờng NST giới tính Số trƣờng hợp bất thƣờng NST thƣờng Koulischer L [32] 1000 27 (2,7) 6 (0,06) Chandley AC [21] 2372 33 (1,4) 18 (0,7) Abyholm T [14] 356 24 (6,7) 10 (2,8) Zuffardi O [68] 2542 175 (6,9) 40 (1,6) Abramsson L [13] 342 6 (1,8) 4 (1,2) Micic M [40] 820 45 (5,5) 9 (1,1) Retief AE [49] 496 25 (5,0) 10 (2,8) Bourrouillou G [20] 952 65 (6,8) 33 (3,4) Nguyễn Đức Nhự [9] 125 21 (16,8%) 5 (4%)
Nghiên cứu này 264 11 (4,4%) 5 (1,9%)
Kết quả ở các nghiên cứu trên cho thấy bất thường NST giới tính có tỷ lệ cao hơn so với bất thường NST thường. Kết quả nghiên cứu của chúng tơi với tỷ lệ bất thường NST giới tính chiếm 4,4% cao hơn hẳn so với tỷ lệ bất thường NST thường 1,9% là hoàn toàn hợp lý.
Các dạng nhiễm sắc thể đồ bất thường ở các trường hợp nghiên cứu được trình bày cụ thể ở bảng dưới đây:
Bảng 3.5: Phân bố các kiểu nhiễm sắc thể đồ bất thƣờng ở bệnh nhân vô sinh nam giới:
Kiểu bất thƣờng Nhiễm sắc thể đồ Số lƣợng Bất thƣờng số lƣợng NST NST giới tính 47,XXY 9 46,XX 1 NST thƣờng 45,XY, der(13:14)(q10:q10) 1 Bất thƣờng cấu trúc NST NST giới tính 46,XY, t(14;X) 1 NST thƣờng 46,XY, t(2q;13q) 1 46,XY, inv(9)(p11q13) 1 46,XY,t(2;8)(q14.2; q24.1) t(3;14) (p23;q13) 1 46,XY,t(5;7;14) (p10;q36;q10) 1 Tổng 16
Kết quả nghiên cứu cho thấy có đến 9/16 trường hợp bất thường nhiễm sắc thể đồ là hội chứng Klinefelter (47,XXY), chiếm tỷ lệ cao nhất trong các kiểu bất thường nhiễm sắc thể đồ. Các kiểu bất thường còn lại chỉ xuất hiện 1 trường hợp bệnh nhân vô sinh nam giới trên tổng số 16 trường hợp có bất thường về nhiễm sắc thể đồ.
Hiện nay, nguyên nhân gây vô sinh do bất thường về NST đang dần dần được làm sáng tỏ hơn, các bất thường NST liên quan tới cả NST giới tính và NST thường. Một số bất thường NST giới tính thường gặp ở bệnh nhân vô sinh nam giới như: Hội chứng Klinefelter (47,XXY); nam giới có nhiễm sắc thể đồ 47,XYY; nam giới có nhiễm sắc thể đồ 46,XX, nam giới dạng khảm 45,X/46,XY, bệnh nhân nam vơ sinh có
bất thường ở NST X, Y;... Bên cạnh đó, những bất thường về NST thường ở bệnh nhân vô sinh nam giới cũng đang từng bước làm sáng tỏ hơn.
Hội chứng Klinefelter có tinh hồn bị teo, khơng có tế bào mầm sinh dục hoặc tế bào mầm sinh dục bị tiêu hủy. Tần suất bệnh là 1/500, nam giới bị hội chứng này có nguy cơ cao bị ung thư vú và loãng xương [51]. Trong kết quả nghiên cứu của đề tài, tỷ lệ hội chứng Klinefelter chiếm tỷ lệ 3,4% thấp hơn so với kết quả nghiên cứu của một số tác giả như: Rima Dada với tỷ lệ bệnh nhân hội chứng Klinefelter cao nhất (8,8%) [50], Trieu Huynh và cs thì nhiễm sắc thể đồ 47,XXY có tỷ lệ cao nhất 11% ở nam giới KCTT và 0,7% ITT [59], ở nghiên cứu của Nguyễn Đức Nhự là 7,2% [9]. Nhưng nhìn chung, các nghiên cứu đều cho thấy bất thường NST kiểu 47,XXY chiếm những tỷ lệ cao nhất so với các bất thường NST khác. Với nghiên cứu gần đây của Palermo và cộng sự đã thành công khi làm ICSI với tinh trùng lấy từ tinh hoàn của những người đàn ông 47,XXY và kết quả là 2 người phụ nữ có thai và sinh ra 3 trẻ bình thường [45]. Những đứa trẻ sinh ra có NST giới tính bình thường đã cho thấy tinh trùng lấy từ tinh hồn của những người nam Klinefelter có bộ đơn bội bình
thường X hoặc Y. Cơ chế có thể do: cơ thể Klinefelter khảm 46,XY/47,XXY có tế bào mầm sinh dục XY trong tinh hoàn (dù là tỷ lệ nhỏ) góp phần vào q trình sinh tinh trùng bình thường hoặc tế bào mầm sinh dục 47,XXY có thể sống sót qua giảm phân tạo tinh trùng đơn bội bình thường.
Bệnh nhân hội chứng 46,XX biểu hiện kiểu hình bên ngồi là nam giới. Theo thống kê trường hợp kiểu hình là nam nhưng kiểu nhân là 46,X,Xt(Xp,Yp) chiếm tỷ lệ 1/10.000 do ở những người này có mang một chuyển đoạn của NST Y lên đầu tận của NST X, đoạn này mang gen SRY (gen xác định giới tính). Đây là trường hợp người bệnh có kiểu hình nam, có hai tinh hồn, hầu hết cơ quan sinh dục giống nam giới bình thường nhưng khơng có NST Y [2]. Trong nghiên cứu cũng đã phát hiện thấy 1 trường hợp bệnh nhân vơ sinh nam giới có nhiễm sắc thể đồ (46, XX). Cho đến nay, hội chứng nam (46,XX) chắc chắn khơng có sự sinh tinh. Do đó, một khi đã xác định là nguời nam bị hội chứng này bằng nhiễm sắc thể đồ thì việc phẫu thuật tìm tinh trùng trong tinh hồn là vơ ích [51].
Bên cạnh những bất thường về số lượng NST thì những sai lệch về cấu trúc NST cũng được các nhà di truyền học tìm ra rất nhiều và phân thành hai loại là bất thường về cấu trúc NST thường và cấu trúc NST giới tính. Bất thường về cấu trúc có thể là mất đoạn, đảo đoạn, chuyển đoạn,... Sự bất thường trong bộ NST có thể gây trở ngại cho sự bắt cặp NST trong quá trình giảm phân và gây tổn hại đến quá trình sinh tinh.
So với NST X, NST Y chứa ít gen hơn nhiều (dưới 50 gen chức năng). Chức năng của phần lớn các gen trên NST Y liên quan đến sự phát triển tuyến sinh dục và
cơ quan sinh dục ở nam giới [2]. Chính vì vậy sự nguyên vẹn của NST Y là rất cần thiết cho sự phát triển bình thường của hệ sinh sản của nam giới. Tùy theo sự bất thường nhiều hay ít của NST Y mà q trình sinh tinh bị ảnh hưởng ở các mức độ khác nhau. Các nhà khoa học đã phát hiện ra trường hợp NST Y có 2 tâm động: có 2 nhánh ngắn, 2 tâm động và một phần nhỏ của đoạn gần nhánh dài, và tìm thấy ở một số ít nam giới khơng tinh trùng do bế tắc [51]. Bên cạnh đó trường hợp NST Y dạng vịng cũng được ghi nhận trong một số ít trường hợp nam giới có sự suy kém q trình sinh tinh [51]. Ngồi những sai lệch cấu trúc trên, ngày nay người ta còn biết thêm một số rối loạn về cấu trúc của NST Y như: đảo đoạn quanh tâm (hầu như không gây ảnh hưởng). Chuyển đoạn tương hỗ giữa NST Y và một NST thường rất hiếm xảy ra, hầu hết nam giới bị chuyển đoạn tương hỗ này bị suy giảm sinh tinh trầm trọng, tuy nhiên một vài người được ghi nhận là vẫn có khả năng sinh sản [23].
Một số bất thường ở NST X đã được nghiên cứu chỉ ra là có liên quan tới khả năng sinh sản ở nam giới. Sự chuyển đoạn giữa NST X và NST thường làm quá trình sinh tinh bị đình trệ nghiêm trọng, dẫn đến tình trạng nam giới KCTT hoặc thiểu tinh [23]. Ngay trong kết quả của nghiên cứu này cũng đã phát hiện ra 1 trường hợp bệnh nhân nam giới vơ sinh có kiểu nhân 46,XY, t(14;X). Ngược lại, sự đảo đoạn của NST X thì về căn bản khơng ảnh hưởng tới khả năng sinh sản của nam giới [23]. Bên cạnh đó, chuyển đoạn giữa NST X và Y tạo nhiều kiểu biến dị khác nhau và thường hình thành bộ NST không cân bằng. Mối liên quan giữa những rối loạn NST với biểu hiện lâm sàng rất phức tạp, kiểu hình có thể là nam hoặc là nữ, khả năng sinh sản có thể bình thường hay bất thường. Trong vài kiểu chuyển đoạn đặc biệt giữa X và Y có thể bị chậm phát triển thể chất và tâm thần [23].
Tuy nhiên, cho đến nay những bất thường NST thường liên quan đến vô sinh nam giới chưa được nghiên cứu sâu rộng. Đối với các đột biến chuyển đoạn cân bằng ở NST thường và chuyển đoạn Robertson thường có biểu hiện nhẹ là sự suy giảm khả năng sinh sản, nặng thì bệnh nhân bị thiếu hụt quá trình sinh tinh [30]. Chuyển đoạn Robertson giữa các NST tâm mút 13, 14, 15, 21 và 22 thường thấy ở những nam giới vô sinh và đặc biệt chuyển đoạn giữa NST 13 và 14 hay gặp hơn cả [60]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng đã phát hiện ra các bất thường liên quan tới các NST trên ở bệnh nhân vô sinh nam giới, như vậy kết quả của đề tài hồn tồn hợp lí so với các nghiên cứu đã được công bố trước đây.
Theo y văn, hội chứng Prader-Willi xảy ra khi mất đoạn gần nhánh dài của NST 15 và cũng gặp trong vô sinh nam [1]. Theo kết quả nghiên cứu của Punam Nagvenkar cũng phát hiện thấy 1 trường hợp vô sinh nam giới có mất đoạn nhánh dài NST số 16, nhiễm sắc thể đồ có dạng 46,XY, del(16)(q12.2)). Sự mất đoạn NST 16 thường cho thấy liên quan đến một số bệnh ung thu võng mạc, ung thư vú, buồng trứng và tuyến tiền liệt [47]. Bên cạnh đó, Lakshim Rao và cs cũng phát hiện được 1
trường hợp nam giới vô sinh mất đoạn ở nhánh ngắn của NST số 4 có nhiễm sắc thể đồ 46,XY,del(4)(p12) và hai trường hợp mất đoạn ở nhánh ngắn NST 13 có nhiễm sắc thể đồ 46,XY,del(13p) [35].
Các bất thường NST sẽ gây ảnh hưởng tới quá trình bắt cặp của các NST trong cặp tương đồng ở quá trình giảm phân tạo giao tử. Các hợp tử có bộ NST bất thường có nguy cơ bị sảy thai cao, nếu quá trình mang thai phát triển bình thường thì cũng làm gia tăng khả năng con cái sinh ra mang dị tật bẩm sinh. Vì vậy, các bệnh nhân vô sinh nam giới cần được tư vấn di truyền cũng như chẩn đoán trước sinh khi áp dụng các kĩ thuật hỗ trợ sinh sản.
Ngoài ra, 248 trường hợp cịn lại chúng tơi khơng phát hiện thấy có rối loạn về cấu trúc hay số lượng NST. Tuy nhiên, các bệnh nhân này có bất thường di truyền ở mức độ đột biến gen hay khơng thì cần được xét nghiệm ADN để xác định chính xác. Cho đến nay những mất đoạn nằm trong vùng AZF trên nhánh dài NST Y đã được nghiên cứu và xác định là có liên quan đến suy giảm sinh tinh trùng hoặc khơng có tinh trùng ở những bệnh nhân vơ sinh nam [11]. Do đó trường hợp bệnh nhân vơ sinh nam giới mà nhiễm sắc thể đồ bình thường thì kết quả phân tích ADN sẽ là cơ sở tư vấn di truyền, chọn giải pháp thích hợp cho bệnh nhân.
3.3. Kết quả phát hiện mất đoạn vùng AZF của NST Y
3.3.1 Hồn thiện quy trình Multiplex PCR nhằm phát hiện mất đoạn vùng AZF ở bệnh nhân vô sinh. ở bệnh nhân vơ sinh.
- Lựa chọn các trình tự mồi:
Các STS đặc hiệu được sử dụng trong phản ứng PCR và số lượng STS cũng là một yếu tố ảnh hưởng tới tỷ lệ mất đoạn nhỏ trên AZF được phát hiện. Có khoảng 300 STS đặc hiệu cho vùng AZF và có thể sử dụng để chẩn đốn các mất đoạn nhỏ. Tuy nhiên, không thể dùng tất cả các STS để xét nghiệm mất đoạn nhỏ vùng AZF vì giá thành xét nghiệm sẽ rất cao và thời gian xét nghiệm sẽ rất dài. Để giải quyết vấn đề này, Học viện nam học Châu Âu (EAA: European Academy of Andrology), khuyến cáo chỉ cần sử dụng 2 STS cho mỗi phân vùng AZF cũng có thể phát hiện trên 90% các mất đoạn nhỏ [56]. Các STS được khuyến cáo để chẩn đoán mất đoạn nhỏ trên vùng AZF là: sY84 và sY86 cho AZFa, sY127 và sY134 cho AZFb, sY254 và sY255
cho AZFc [55]. Tuy nhiên, tính đặc hiệu của các STS này đối với các mất đoạn nhỏ còn là điều gây tranh cãi.
Trong nghiên cứu này, các STS được khuyến cáo bởi Học viện nam học Châu Âu được sử dụng với một sự thay đổi nhỏ. Các STS cho AZFa và AZFb được giữ nguyên. Để chẩn đoán mất đoạn nhỏ vùng AZFc, sY255 được thay thế bằng sY153. Một lý do cho sự thay thế này là sY255 nằm rất gần sY254 trên vùng DAZ và chúng hay bị tổn thương cùng nhau. Việc chọn sY153 có thể giúp phát hiện những mất đoạn nhỏ trên AZFc ở ngoài vùng DAZ.
Như vậy, đề tài sử dụng 6 cặp mồi: sY86, sY127, sY254, sY84, sY134, sY153 nhằm phát hiện mất đoạn trên các vùng AZFa, AZFb, AZFc. Cùng với đó, tiến hành chạy thêm với cặp mồi SRY với vai trò là đối chứng dương nội tại.
Bảng 3.6: Trình tự 7 cặp mồi chạy Multiplex PCR [16]
S TT K ích thƣớc S TS V ị trí Trình tự mồi a 1 72 bp 4 RY S RY S F F 5′-GAATATTCCCGCTCTCCGGA-3′ R R 5′-GCTGGTGCTCCATTCTTGAG-3′ a
2 20 bp 3 Y86 s ZFa A F F GTGACACACAGACTATGCTTC-3′ 5-